卢晓锋
LU Xiaofeng
中图分类号: TG178
文章编号: 0412-1961(2017)10-1402-11
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收稿日期: 2017-07-12
网络出版日期: 2017-10-11
版权声明: 2017 《金属学报》编辑部 《金属学报》编辑部
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作者简介 卢晓锋,男,1985年生,硕士生
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摘要
为调控生物活性Ti金属材料的生物活性,使用灭活的细菌生物膜对其进行杂化。金黄色葡萄球菌(S.aureus)在纯Ti (P-Ti)和酸碱处理Ti (AA-Ti)表面培养5 d后在121 ℃、0.13 MPa条件下灭活30 min,获得细菌生物膜杂化的纯Ti (BP-Ti)和酸碱处理Ti (BAA-Ti)。BCA蛋白分析和苯酚-硫酸分析表明,在BAA-Ti表面的细菌生物膜的细胞外基质较BP-Ti表面细菌生物膜的细胞外基质含较多蛋白,而后者含有较多的多糖。酶免疫分析表明,在BP-Ti和BAA-Ti表面的肠毒素都低于阈值。模拟体液(SBF)浸泡实验表明,BAA-Ti和BP-Ti在5 d内均可诱导磷灰石形成,但BAA-Ti诱导磷灰石能力低于BP-Ti。AA-Ti在1 d内可诱导磷灰石生成,但在5 d内P-Ti表面无磷灰石生成。表明生物膜提高了BP-Ti的生物活性,但降低了BAA-Ti的生物活性。这可能源于生物膜中多糖有利于促进磷灰石的形成,而其中的蛋白抑制磷灰石的形成。MG-63细胞培养实验表明,细胞增殖能力顺序为：BAA-Ti <BP-Ti <AA-Ti<P-Ti,表明生物膜中的蛋白抑制细胞的增殖。Ti表面杂化的生物膜显著影响Ti金属材料的生物学性能,可通过表面杂化生物膜的方式实现对Ti的生物活性的调控。
关键词：
Abstract
Bacterial biofilm contained with proteins and polysaccharides, which made it have the potential to mimic extracellular matrix for tissue repair. It also has the properties to attach the substrate firmly. In order to regulate the bioactivity of titanium metal, inactivated bacterial biofilm was hybridized on the metal surfaces. Staphylococcus aureus (S.aureus) was cultured for 5 d on pure titanium metal (P-Ti) and that subjected to acid-alkali treatment (AA-Ti), and then the bacteria was inactivated at 121 ℃ and 0.13 MPa for 30 min to get hybridized titanium metals BP-Ti and BAA-Ti respectively. BCA (bicinchoninic acid) assay and phenol-sulfuric acid analysis showed the extracellular matrix (ECM) in the biofilm on BAA-Ti contented less polysaccharide and more protein than that on BP-Ti. Enzyme immunoassay showed the staphylococcal enterotoxins in both biofilms were lower than the threshold value. SBF (simulated body fluid) soaking experiments showed both BAA-Ti and BP-Ti could induce apatite formation after 5 d, and BAA-Ti induced less apatite than the BP-Ti did. The AA-Ti could induce apatite formation at 1 d, but there is no apatite formation on P-Ti even after 5 d. It indicated that the biofilm decreased the bioactivity of BAA-Ti, but increased the bioactivity of BP-Ti. This effect might depend on the roles of proteins and polysaccharide in the biofilms which could restrain the apatite formation for the former, and accelerate the apatite formation for the later. When osteosarcoma cell MG-63 was cultured on the metals for 3 d, the cell proliferation ability on the metals followed by the order of BAA-Ti<BP-Ti<AA-Ti<P-Ti, which indicated that the proteins might inhibit the cell proliferation. The biofilms hybridized on titanium metal could influence the biological response of titanium metal. It might be possible to regulate the bioactivity of titanium by biofilm hybridization.
Keywords：
Ti金属材料因其优异的生物相容性和力学性能,已在生物材料领域得到广泛的应用[1]。但是因为其缺乏生物活性,科研人员采取多种方法对其进行表面改性,以提高其生物活性,如碱热处理、酸碱处理、阳极氧化(微弧氧化)等[2-6]。但这些方法制备的生物活性Ti表面缺少生物学组分,例如蛋白和多糖等。这些生物分子在生物体内具有调节细胞活性并调控细胞生长的能力[7,8]。因此,如果Ti表面具有模拟细胞外基质的结构,富含蛋白与多糖,将是最为理想的表面结构。近年来,一些生物分子,包括胶原、透明质酸等已被用于Ti金属表面改性[9]。但是由于这些生物分子与Ti基底间缺乏有效的结合方式,很难将这些分子固定在金属表面。同时细胞外基质的组分极为复杂,很难通过单纯的生物分子表面改性完全模拟细胞外基质的结构和功能。
细菌生物膜含有多种蛋白和多糖,并且细菌生物膜与基底材料间具有牢固的结合,因此细菌生物膜很难从基底材料表面去除[10-13]。细菌生物膜中的蛋白和多糖经过灭活以后,可能提供与胶原、透明质酸相似的功能,起到模拟细胞外基质的作用。本工作使用灭活细菌生物膜杂化Ti金属表面,考察生物膜杂化对金属表面生物学性能的影响。
商业途径获得的纯Ti (P-Ti)经线切割获得直径12 mm、厚1 mm的Ti片,将Ti片经酸碱处理后获得酸碱处理Ti (AA-Ti)。酸碱处理过程为：将Ti片放入由98%H2SO4 (质量分数,下同)、37%HCl和去离子水按照1:1:2的体积比配制的溶液中,在70 ℃条件下处理5 h,然后在6 mol/L NaOH溶液中在70 ℃下处理5 h,最后清洗烘干待用。采用Y-2000 X射线衍射仪(XRD)和S-4800扫描电镜(SEM)考察Ti片表面的结构与组分。
将浓度为1×106 cfu/mL的1 mL金黄色葡萄球菌(S.aureus,ATCC 25923)悬液,加入放置有P-Ti或者AA-Ti的24孔培养板中,在37 ℃条件下共培养1、3和5 d。共培养后,将部分样品取出,使用2.5%戊二醛在4 ℃条件下固定24 h后,采用乙醇梯度脱水,随后进行临界点干燥,最后进行XRD及SEM观测分析。共培养5 d后,部分样品放入24孔板中,加入1 mL PBS (phosphate buffer saline)缓冲溶液,再加入200 μL 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT),在37 ℃下孵育30 min,采用MTT法考察Ti材料表面的细菌量。
共培养5 d后,Ti表面的细菌生物膜在高温高压(121 ℃,0.13 MPa)下灭活30 min,获得细菌生物膜杂化的纯Ti (BP-Ti)和酸碱处理Ti (BAA-Ti)。BP-Ti和BAA-Ti使用PBS缓冲液轻轻清洗后,使用PI (propidium iodide,50 μg/mL)溶液染色,采用TCSSP5激光共聚焦显微镜(CLSM)考察BAA-Ti和BP-Ti表面细菌生物膜的厚度。
灭活获得BP-Ti和BAA-Ti后,立即使用PBS洗脱收集生物膜中的蛋白和多糖。一部分含蛋白和多糖的PBS溶液将其置于超声波中震荡10 min,待破坏细菌生物膜的结构后,采用BCA法[14] (Pierce, USA)和苯酚-硫酸法[15-17]考察生物膜中的蛋白总量和多糖总量。另一部分含蛋白和多糖的PBS溶液经离心去除细菌颗粒后,同样采用BCA法和苯酚-硫酸法考察细菌生物膜中细胞外基质中的蛋白总量和多糖总量。
采用酶免疫检测试剂盒(R-Biopharm AG)检测BP-Ti和BAA-Ti表面细菌生物膜中的肠毒素(staphylococcal enterotoxins,SE) A、B、C、D和E的光密度(OD)。其操作按照试剂盒的说明书进行。
采用MFP-3D BIO原子力显微镜(AFM)检测P-Ti、AA-Ti、BP-Ti和BAA-Ti的形貌及其表面电势[18]。其中P-Ti和AA-Ti的表面电势直接进行检测,BP-Ti和BAA-Ti首先在去离子水中浸泡3 min以去除其中的离子,在大气中干燥20 min,再滴加5 μL的去离子水保持其表面湿润,再检测其表面电势。
采用文献[19]的方法配制传统的SBF溶液。在37 ℃条件下将P-Ti、AA-Ti、BP-Ti和BAA-Ti浸泡在20 mL SBF溶液中1、3、5 d。每天更换SBF溶液。从SBF中取出样品后,用去离子水轻轻清洗、烘干,使用SEM、XRD及Nicolet 6700 Fourier红外光谱仪(FTIR)考察各样品表面诱导磷灰石形成的能力。
MG-63骨肉瘤细胞被用于本实验的细胞学评价。含10%的小牛血清和1%的抗生素的DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium,Gibco)培养基用于细胞培养。培养条件为37 ℃的5%CO2 (体积分数)环境。细胞浓度为1×104 cells/mL。在放有Ti金属材料的24孔培养板中各加入1 mL细胞悬液,每天更换培养液,培养1、2、3 d后,采用MTT法考察细胞在各种金属材料表面的生物活性[20,21]。每个时间点每种样品采用5个样品进行MTT平行实验,实验结果使用SPSS11.0软件进行统计学分析,并进行显著性分析(p<0.05)。
采用荧光染色的方法考察细胞形貌的生长变化。在相应时间点,使用PBS清洗样品后,采用FDA (fluorescein diacetate,50 μg/mL in PBS)对细胞进行染色,采用PBS再次清洗后,使用CLSM观察细胞形态。细胞培养3 d后,样品使用戊二醛固定并经乙醇梯度脱水后,临界点干燥后喷金进行SEM观察。
图1给出了生物膜杂化前的P-Ti和AA-Ti的SEM和XRD结果。P-Ti具有光滑的表面,并只有Ti的衍射峰;AA-Ti中含有少量TiH1.5的衍射峰,并具有网络状的多孔结构。
图1 纯Ti (P-Ti)及酸碱处理Ti (AA-Ti)表面的SEM像及XRD谱
Fig.1 SEM images (a, b) and XRD spectra (c, d) of P-Ti (a, c) and AA-Ti (b, d) without biofilm
S.aureus在Ti表面培养1和3 d后,材料表面还未被细菌完全覆盖;而5 d后,材料表面被细菌完全覆盖(图2)。XRD表明,此时测得的表面晶体结构没有变化,说明表面覆盖的生物膜中的物质结晶度较低(图3)。
图2 金黄色葡萄球菌(S.aureus)在P-Ti及AA-Ti表面培养1 d后的SEM像
Fig.2 SEM images of P-Ti (a~c) and AA-Ti (d~f) cultured with S.aureus for 1 d (a, d), 3 d (b, e) and 5 d (c, f)
图3 S.aureus在P-Ti及AA-Ti表面培养5 d后的XRD谱
Fig.3 XRD spectra of BP-Ti (a) and BAA-Ti (b) cultured with S.aureus for 5 d
MTT测试结果表明,培养5 d后,在AA-Ti表面较P-Ti表面有更多的细菌,但两者的细菌生物膜的厚度没有显著的差别。
BP-Ti和BAA-Ti表面细菌生物膜中的蛋白总量和细胞外基质中的蛋白量测试结果表明,在BAA-Ti表面的生物膜中的蛋白及细胞外基质中蛋白的总量均较BP-Ti表面多,这与其表面的细菌总量较多的状况一致。
BP-Ti和BAA-Ti表面培养5 d后生物膜中的总多糖和细胞外基质中的多糖含量测试表明,BAA-Ti表面生物膜中含有较多的多糖,而在BP-Ti表面的细胞外基质中含有较多的多糖,并且上述2种物质的含量的差异存在显著性(p<0.05)。
图4表明AA-Ti和BAA-Ti分别较P-Ti和BP-Ti拥有更为粗糙的表面;在生物膜杂化的表面,较未杂化的表面有较多的微凸起结构。
图4 P-Ti、AA-Ti、BP-Ti及BAA-Ti的AFM像
Fig.4 AFM images of P-Ti (a), AA-Ti (b), BP-Ti (c) and BAA-Ti (d)
AFM表面电势测量结果显示(图5),AA-Ti表面有-279.2 mV的负电势,表明其表面有较多的负电荷;BP-Ti表面有-57.6 mV的负电势,其表面也可能含有较多的负电荷;而BAA-Ti和P-Ti表面的电势分别为280.1和207.5 mV,表明在本实验条件下获得的BAA-Ti及P-Ti表面可能带有正电荷。表面电势具有如下规律：AA-Ti<BP-Ti<P-Ti<BAA-Ti。
图5 P-Ti、AA-Ti、BP-Ti及BAA-Ti的AFM表面电势分布
Fig.5 AFM images of the surface potential of P-Ti (a), AA-Ti (b), BP-Ti (c) and BAA-Ti (d)
图6给出了BAA-Ti和BP-Ti表面的肠毒素A~E的OD值。在2种表面,肠毒素A、C、D、E的含量未显示出显著性差异,但在BAA-Ti表面的肠毒素B较BP-Ti表面更多(p<0.05)。
图6 BAA-Ti和BP-Ti表面生物膜中的肠毒素A、B、C、D、E的OD值
Fig.6 Optical density (OD) of staphylococcal enterotoxins (A, B, C, D and E) on BAA-Ti and BP-Ti(**—p<0.05)
图7给出了在SBF中浸泡不同时间后各样品表面的SEM像。在SBF中浸泡1和3 d后,在P-Ti、BP-Ti和BAA-Ti表面未发现沉积物,而AA-Ti表面为一层沉积物所覆盖。浸泡5 d后,P-Ti表面依然无沉积物呈现,而BP-Ti、AA-Ti和BAA-Ti表面均被沉积物覆盖。上述沉积物与文献中的类骨磷灰石具有相似的结构。XRD证实其为磷灰石结构[22] (图8)。在XRD谱中明显看出,在BAA-Ti表面磷灰石沉积速率低于AA-Ti表面。FTIR谱(图9)显示,浸泡1 d后,AA-Ti表面在1022、959和870 cm-1呈现了PO4的特征峰[23],在BAA-Ti和BP-Ti表面,出现了1639、1527和1399 cm-1的酰胺I带和酰胺II带的特征峰[24,25]。说明在浸泡1 d时,AA-Ti诱导了磷灰石的形成,在BAA-Ti和BP-Ti表面有蛋白质存在。浸泡3 d时的FTIR谱与1 d时相似。浸泡5 d后,在AA-Ti、BAA-Ti和BP-Ti表面均出现了1022、959和870 cm-1位置的PO4特征峰。
图7 P-Ti、BP-Ti、AA-Ti及BAA-Ti在SBF中浸泡不同时间后表面SEM像
Fig.7 Surface SEM images of P-Ti (a1~a3), BP-Ti (b1~b3), AA-Ti (c1~c3) and BAA-Ti (d1~d3) after soaked in SBF for 1 d (a1~d1), 3 d (a2~d2) and 5 d (a3~d3)
图8 P-Ti、BP-Ti、AA-Ti和BAA-Ti在SBF中浸泡不同时间后的XRD谱
Fig.8 XRD spectra of P-Ti, BP-Ti, AA-Ti and BAA-Ti after soaked in SBF for 1 d (a1, a2), 3 d (b1, b2) and 5 d (c1, c2)
图9 P-Ti, BP-Ti, AA-Ti 和 BAA-Ti在SBF中浸泡不同时间的FTIR谱
Fig.9 FTIR spectra of P-Ti, BP-Ti, AA-Ti and BAA-Ti after soaked in SBF for 1 d (a1, a2), 3 d (b1, b2) and 5 d (c1, c2)
图10给出了MG-63细胞在材料表面培养1、2和3 d后的MTT检测结果。1 d后,在所有材料表面的细胞没有显示出显著性差异。2 d后,P-Ti表面和AA-Ti表面的细胞分别比BP-Ti表面和BAA-Ti表面增殖更多的细胞,但BP-Ti和BAA-Ti表面的细胞和第1 d时的状况相比没有显著性差异。在第3 d时,P-Ti和AA-Ti表面的细胞依然比BP-Ti和BAA-Ti表面增殖得更好,在所有材料表面的细胞均较第1和第2 d时增殖更多。BAA-Ti表面的细胞在各个时间点的增殖均较其它材料表面的细胞慢。
图10 MG-63细胞在材料表面培养不同时间后的MTT分析结果
Fig.10 MTT assay of MG-63 cultured on the specimens for different days
图11给出了各种材料表面的细胞在各个时间点的CLSM分析结果。在1 d时,BAA-Ti表面的细胞呈现圆形,AA-Ti、P-Ti以及BP-Ti表面的细胞呈梭形。2 d时,除BAA-Ti表面外,其它材料表面的细胞均增殖良好,呈梭形。在3 d时,细胞显示出与第2 d时相似的情况。
图11 MG-63细胞在材料表面培养不同时间后的CLSM分析结果
Fig.11 CLSM of MG-63 cultured on P-Ti (a1~a3), BP-Ti (b1~b3), AA-Ti (c1~c3) and BAA-Ti (d1~d3) for 1 d (a1~d1), 2 d (a2~d2) and 3 d (a3~d3)
SEM结果(图12)显示,培养3 d后,MG-63细胞在所有材料表面均有伪足,并且扩展良好。材料表面灭活后的细菌均已消失。
图12 MG-63细胞在材料表面培养3 d后的SEM像
Fig.12 SEM images of MG-63 cultured on P-Ti (a), BP-Ti (b), AA-Ti (c) and BAA-Ti (d) for 3 d
本工作表明,Ti表面杂化的细菌生物膜可以显著影响材料的生物学性能。表面杂化的生物膜可增强纯Ti的诱导磷灰石形成的能力,但是削弱了酸碱处理Ti的磷灰石诱导能力;同时杂化的细菌生物膜降低了纯Ti以及酸碱处理Ti对MG-63细胞的生物相容性,使得细胞在其表面的增殖能力降低。研究还表明,在BAA-Ti表面的生物膜细胞外基质中,较BP-Ti表面的生物膜细胞外基质中有更多的蛋白,同时又有较少的多糖。
鉴于生物膜灭活后,细菌内部的蛋白和多糖依然为细胞膜所包裹,因此,在本实验中生物膜中细胞外基质中的蛋白和多糖对其生物学性能的影响更为显著。Miyahara等[26]和Travan等[27]的研究表明,多糖具有促进骨生长的能力,这与本工作观察到的现象一致,BP-Ti表面细胞外基质中有更多的多糖,因此,它较BAA-Ti具有更强的磷灰石诱导能力。不同的蛋白质在磷灰石诱导过程的作用有所不同,一些蛋白具有加速磷灰石成核的能力,而另一些蛋白具有抑制磷灰石成核的能力[28]。本工作表明,生物膜中的蛋白不利于磷灰石的沉积。
Ti金属材料表面的Ti—OH被认为与其生物活性密切相关[29]。一般认为Ti—OH的负电荷诱导生物活性反应的发生。材料表面拥有越多的负电荷,越有利于提高其生物活性。本工作表明,材料表面杂化生物膜后,表面含有多糖。而多糖在生理环境下的水解,使其表面富含负电荷[30],从而使BP-Ti和BAA-Ti具有诱导磷灰石沉积的能力。
AFM研究表明,材料表面的电势为AA-Ti<BP-Ti<P-Ti<BAA-Ti。其中除BAA-Ti外,这一顺序与其诱导磷灰石形成的能力一致,即AA-Ti>BP-Ti>P-Ti。实验测得BAA-Ti的表面电势为280.1 mV,具有正电势,这可能与其表面较多的细菌体有关。细菌体如何影响其诱导磷灰石形成的能力,还有待进一步的考察。
Cai等[8]报道多糖具有优良的生物相容性,同时Carre和Lacarrière[31]报道,一些蛋白将抑制细胞的黏附。本工作表明,杂化生物膜后的表面,不利于细胞的黏附和生长增殖。这与生物膜中的蛋白的作用可能具有密切的关系。BAA-Ti表面的细胞黏附生长能力与其它材料相比,明显显示出劣势,这与其生物膜细胞外基质中的蛋白含量具有一致性。同时,Nagaki等[32]报道肠毒素B具有致死实验动物的风险。本工作发现,在BAA-Ti表面的生物膜中含有较多的肠毒素B,因此材料表面的肠毒素也可能是导致BAA-Ti表面细胞相容性降低的原因。但是,按照试剂盒提供的计算方法,生物膜中的肠毒素A、B、C、D、E的OD值低于其阈值(0.191),因此生物膜杂化的Ti材料是安全的。试剂盒给出的阈值为OD平均值+0.15,其中本工作中的OD平均值为0.041。
Ti表面杂化灭活细菌生物膜后,可显著影响材料的生物学性能。生物膜可加速P-Ti表面磷灰石的生长,但减缓AA-Ti表面磷灰石的生长能力。同时生物膜抑制材料表面细胞的黏附和生长,在BAA-Ti表面的抑制作用尤为明显。采用灭活细菌生物膜,可调控Ti金属材料的生物学性能。
The authors have declared that no competing interests exist.
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