Ti及其合金是目前已知的综合性能最好的生物医用金属材料^[1],已经成为人工关节、骨科创伤产品、牙种植体、人工心脏瓣膜、介入性心血管支架等医用植入体的首选材料^[2]。但是,Ti及其合金在临床应用中仍有许多性能待提升,如在生理环境下的耐腐蚀性能、力学性能和耐磨性能等。此外,Ti及其合金属于生物惰性材料,不具备生物活性,骨再生能力差^[3-5];且植入体表面缺乏抗菌性,易发生细菌感染^[6,7]。因此,欲改善Ti材料植入效果,需同时提高其表面力学性能、耐腐蚀性、生物活性及抗菌性等。

等离子体浸没离子注入与沉积(plasma immersion ion implantation & deposition,PIII&D)技术具有全方位和高反应活性的特点,对于处理体积小且异形的植入体材料具有独特的优势^[8,9]。PIII&D技术可以将多种元素或者化学官能团引入材料表面,实现对材料力学性能^[10-14]、耐腐蚀性能^[15,16]、生物活性^[17,18]以及抗菌性^[19,20]的调控,在生物医用金属表面改性领域具有较佳应用前景。注入离子的选择对基体性能有较大影响,前期研究表明铝离子注入可提高Ti基体的耐腐蚀性能^[28],镁、钙和锌离子注入可增强Ti的成骨能力^[29-31],银、铜、铁和氟离子注入可赋予Ti较佳的抗菌性能^[32-35]。

C是构成人体的主要元素,具有较高的生物安全性,同时具有较佳的化学和物理性能,如较强的化学惰性和摩擦学性质等。含C涂层可显著提高基体材料的抗腐蚀性能、耐磨性能^[36,37]。C作为生物材料的表面改性元素有较为明显的优势。本工作采用PIII&D技术在Ti表面构建了碳离子注入改性层,系统研究碳离子注入对Ti基体力学性能、抗腐蚀性能、抗菌性能和细胞相容性能的影响,相关结果对生物医用Ti的表面设计具有积极意义。

1 实验方法

1.1 碳等离子体浸没离子注入与沉积(C-PIII&D)

采用PIII&D技术将碳离子注入到纯Ti表面,实验步骤如下：

(1) 将商业纯Ti切割为10 mm×10 mm×1 mm的Ti片。用混酸(体积比HF:HNO₃:H₂O=1:5:4)在超声条件下清洗Ti片2遍,每遍5 min,以去除Ti片表面油污及氧化层,得到较为均匀的微结构。连续用酒精、超纯水反复超声清洗样品若干遍,以去除其表面残留的酸液及其它杂质,随后常温干燥并妥善保存。

(2) 采用PIIIS-700多功能离子注入与沉积设备制备样品,高纯高强石墨为阴极离子注入源。将样品放置在PIII&D设备真空室中的靶台上,抽真空至室内压力为5×10^-3 Pa。表1列出了实验工艺参数。碳离子注入0.5和1 h的样品分别标记为C0.5和C1。

1.2 样品表面物理化学性能表征

采用S-3400扫描电子显微镜(SEM)观察样品表面形貌。用PHI 5802X射线光电子能谱(XPS)表征样品表面元素组成和化学状态,MgK_α (1253.6 eV)。采用LabRam HR800Raman光谱仪检测样品表面的Raman振动与结晶相,实验激发波长为514 nm,光谱分辨率为1 cm^-1。

采用SL200B接触角仪测试样品的表面润湿性。通过注射器将1 μL超纯水垂直悬滴到样品表面,经成像系统拍摄照片并分析水在样品表面接触角。测试设3个平行样,每个样品选取3个点作为测试点,取9个测试数据的平均值为实验结果。

通过Surpass电动分析仪检测样品表面的Zeta电位ζ。在每组样品中选取2个尺寸为20 mm×10 mm×1 mm的试样,将它们面对面的平行夹在样品台上,并在2个试样中间留有一定的间隙以便于电解液通过。测试所选择的电解液为0.001 mol/L的KCl溶液,pH值由HCl和NaOH溶液调节,范围为5.0~9.0。在一定的pH值下,仪器通过测量样品表面的流动电流,结合电解液和样品尺寸参数,根据Helmholtz-Smoluchowski公式自动计算ζ^[32]：

ζ=dIdP×ηε×ε0×LA(1)

式中,dI/dP表示流动电流对压力差的斜率,η、ε₀和ε分别表示电解液的黏度、真空介电常数和介电常数,L和A分别是电解液流动通道的长度和横截面积。在每个pH值下测量4次Zeta电位,取4次测量的平均值(±标准差)为最终数据。

采用G200纳米压痕仪评价碳离子注入前后样品的Vickers硬度,每个试样选取3个点测试其硬度。

采用CHI760C电化学工作站评价碳离子注入前后材料的耐腐蚀性能。测试样品作为工作电极,石墨作为对电极,饱和甘汞电极为参比电极。以生理盐水(0.9%NaCl溶液,质量分数)为电解液,常温下测定碳离子注入样品和未改性样品的动电位极化曲线,扫描速率0.01 V/s。

1.3 样品表面细菌黏附评价

采用革兰氏阴性的大肠杆菌(E. coli)评价样品上的细菌黏附能力。实验方法如下：将经75%酒精(体积分数)灭菌的样品放置在24孔板中,每个样品表面滴加100 μL细菌浓度为10⁶ cfu/mL的菌液。细菌在样品表面培养12 h后,用2.5% (体积分数)的戊二醛溶液将细菌固定4 h,随后用体积分数为30%、50%、75%、90%、95%和100%的梯度浓度酒精对样品进行脱水干燥处理。样品喷铂后用S-3400 SEM观察细菌数量及形态。

1.4 体外细胞行为评价

选用小鼠成骨细胞MC3T3-E1评价细胞在材料表面的黏附铺展行为和增殖活性。

1.4.1 细胞培养 使用含10% (体积分数)胎牛血清(FBS)、100 U/mL链霉素和100 U/mL青霉素的达尔伯克改良伊格尔培养液(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)培养MC3T3-E1细胞,培养环境为37 ℃恒温且含有5%CO₂ (体积分数)的潮湿气氛,细胞培养液每3 d更换1次;当细胞融合率达到80%时,用胰蛋白酶/EDTA液 (0.25%胰蛋白酶(质量体积比),0.02%EDTA (体积分数),EDTA—乙二胺四乙酸)将细胞消化传代后再培养,3~5代细胞用于细胞实验。

1.4.2 细胞黏附铺展行为 经75%酒精灭菌的样品置于超净台晾干,随后置于24孔细胞培养板中,每孔滴加1 mL含有浓度为5×10⁴ mL^-1的MC3T3-E1细胞悬液,轻微摇晃均匀后将细胞培养板放入5%CO₂饱和湿度的37 ℃恒温培养箱,分别培养1、4和24 h,取出样品并用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗样品2遍,将样品移至新的24孔板内,每孔加入0.5 mL 4%多聚甲醛(质量分数,PFA)固定细胞10 min;用PBS清洗样品2遍后,加入0.5 mL 0.1% 曲通(体积分数,Triton X-100)室温下对细胞通透2 min;用PBS清洗样品2遍后加入1 mL的1%牛血清白蛋白(质量分数,BSA),浸泡5 min后在每个样品表面滴加0.1 mL鬼丙环肽(FITC-Phalloidin)室温下对细胞骨架和肌动蛋白进行染色,避光放置1 h后用PBS清洗样品2遍,每孔滴加0.5 mL 4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)室温下对细胞核进行染色,避光放置5 min后用PBS清洗样品2遍,加入抗荧光淬灭剂,用盖玻片将样品封好,在GX71荧光显微镜下观察细胞骨架和肌动蛋白表达情况。

1.4.3 细胞增殖活性 采用阿尔玛蓝(AlamarBlue^TM)试剂盒检测样品表面的细胞增殖行为。将75%酒精灭菌的样品放入24孔板,每孔滴加1 mL含有浓度为3×10⁴ mL^-1的MC3T3-E1细胞悬液,放入5% CO₂饱和湿度的37 ℃恒温培养箱培养,期间每3 d更换培养液。培养1、4和7 d后,吸出原培养液,加入0.5 mL含有10%阿尔玛蓝染液的新培养液,继续培养2 h后,从每孔吸取100 μL培养液放入96孔板中,用ELX800酶标仪测量其在550 nm波长处激发和590 nm波长处发射的荧光强度。每组取4个样品作为平行样品进行细胞培养,取其平均值(±标准偏差)作为最终细胞增殖率结果。

1.5 统计学分析

使用GraphPad Prism统计分析软件进行数据分析,通过一维方差分析和Tukey多组对比实验分析不同组实验变量间是否有显著差异。每组变量至少包含3个有效值,显著差异水平设定为p=0.05,p<0.05表示数据在统计学上存在显著差异。

2 实验结果与讨论

2.1 样品表面的物理化学性质分析

图1为碳离子注入前后Ti表面形貌的SEM像。可以看出,碳离子注入前后样品表面形貌无明显变化,均呈现混酸处理得到的沟壑状结构。

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图1   样品表面的SEM像

Fig.1   Surface SEM images of Ti (a), C0.5 (b) , C1 (c) samples

图2为Ti、C0.5和C1样品表面的Raman光谱。从图2a可知,没有进行C-PIII&D处理的Ti样品表面在位移为1200~2000 cm^-1处无峰,说明Ti表面在该范围内不会产生Raman散射。由图2b可知,C0.5样品Raman光谱的特征峰也不明显。图2c为C1样品Raman峰的拟合结果,图中出现了类金刚石(diamond-like carbon,DLC)特征峰,即1350 cm^-1附近的D峰及1590 cm^-1附近的G峰^[21]。其中G峰是DLC膜中所有的石墨状SP²杂化C—C键散射的结果,来源于sp² C键的所有伸缩振动模式;而D峰则只反映了六原子环C结构的散射。

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图2   Ti、C0.5和C1的Raman光谱

Fig.2   Raman spectra of Ti (a), C0.5 (b), C1 (c) samples

图3a和b分别为样品C0.5和C1的C1s高分辨XPS谱及其拟合峰,据此计算出的各峰的面积分数列于表2。从图3可知,样品C0.5和C1的C1s的高分辨谱均由4个特征峰构成,其中285.0 eV特征峰和285.6 eV特征峰对应于无定形碳的C1s^[22],277.1 eV特征峰则对应于结晶石墨C1s^[23],288.5 eV对应于C—O键^[24,25]。

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图3   样品C0.5和C1的C 1s的高分辨XPS谱

Fig.3   C 1s high resolution XPS spectra obtained from the surface of C0.5 (a) and C1 (b) samples

由表2可知,C0.5和C1样品的无定形碳含量分别为88.9%和91.5%,说明随着碳离子注入时间的增加,Ti表面的无定形碳的含量逐渐增多。

碳离子注入前后表面润湿接触角如图4所示,未经改性的Ti表面的润湿接触角约为64°,碳离子注入后样品润湿接触角增大,C0.5和C1样品的表面润湿接触角分别约84°和73°。

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图4   样品表面的润湿接触角

Fig.4   Water contact angles of various samples (p—statistically significant difference, **p<0.01, ***p<0.001)

图5是纯Ti、C0.5及C1样品表面的ζ随溶液pH值变化的曲线。由图可见,3组样品表面的ζ均随着电解液pH值的增大而下降。人体生理环境中的pH值大约为7.4,在该pH值下,C1和C0.5样品的ζ差别不大,电位大约为-68 eV,而未经碳离子注入的Ti表面的电位大约为-50 eV。经过碳离子注入表面改性后,表面电位的绝对值增大,这可能与样品表面存在C—O键有关。

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图5   碳离子注入前后Ti表面Zeta电位随电解液pH值的变化曲线

Fig.5   Zeta potential variations vs pH acquired from titanium surface before and after C-PIII&D

碳离子注入前后Ti表面纳米硬度变化曲线如图6所示。相较于纯Ti样品,C0.5样品表面硬度未见明显变化,其数值最终稳定在5.6 GPa左右;而C1样品表面的硬度明显增大,在50 nm左右达到最大值,硬度超过10 GPa,随后硬度缓慢下降,最终稳定在8 GPa左右。以上数据表明碳离子注入能够改善Ti表面的力学性能。

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图6   碳离子注入前后Ti表面纳米硬度变化曲线

Fig.6   Nano-hardness of titanium surface before and after C-PIII&D

图7为改性前后样品在0.9%NaCl溶液中的动电位极化曲线。相对于未经碳离子注入改性的Ti表面,改性样品的腐蚀电位均正向移动。腐蚀电位是在没有外加电流时金属达到稳定腐蚀状态测得的电位, 其正值越大,材料越不容易被腐蚀。这说明碳离子注入的Ti表面耐腐蚀性能提高。碳离子注入后的Ti表面会形成一层主要含有无定形碳的改性层,由于无定形碳具有良好的化学稳定性和耐腐蚀性能^[38],碳离子注入后的Ti表面耐腐蚀性能提高。另外从图7可知,C1样品表面比C0.5样品表面具有更好的耐腐蚀性能,这是因为随着碳离子注入时间的增加,C1样品表面比C0.5样品表面的无定形碳含量要高。

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图7   碳离子注入前后Ti表面的动电位极化曲线

Fig.7   Polarization curves of samples in 0.9%NaCl solution before and after C-PIII&D

2.2 样品表面细菌黏附评价

选用大肠杆菌评价细菌在碳离子注入样品表面的黏附能力。将在样品表面培养12 h的大肠杆菌用2.5%戊二醛溶液固定后,观察样品表面细菌的形貌,结果如图8所示。碳离子注入样品和原始Ti表面均有大肠杆菌的黏附,但是大肠杆菌的数量存在明显差异,相较于对照样Ti,C0.5和C1样品表面的大肠杆菌黏附量减少,其中C1样品对细菌黏附的抑制作用尤为明显。

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图8   大肠杆菌在碳离子注入改性前后样品表面培养12 h后的SEM像

Fig.8   SEM images of the E. coli seeded on the various surfaces after 12 h inclubation
(a) Ti (b) C0.5 (c) C1

细菌在材料表面的黏附主要包括2个阶段：第一阶段为初始的物理化学相互作用,第二个阶段为分子与细菌的相互作用^[26]。在材料的各种界面参数中,表面粗糙度和化学组成被认为是与材料和细菌相互作用相关的2个重要因素。C-PIII&D改性前后样品表面形貌变化不大,因此,样品表面的粗糙度对大肠杆菌黏附的影响可忽略不计,细菌的黏附情况主要受控于样品表面的化学组成。根据XPS结果,经碳离子注入改性样品的表面主要成分为无定形碳,该碳膜具有化学惰性,弱化了样品与细菌的化学作用,从而可有效抑制细菌黏附^[27]。其次,材料表面润湿性也能够影响细菌的黏附作用。由图4可知,经碳离子注入,样品表面的润湿接触角增大,相对疏水的表面将对细菌黏附造成不利影响。此外,由Zeta电位测试可知,在pH值为7.4时,C0.5和C1样品的表面Zeta电位要负于Ti样品的表面Zeta电位。细菌膜表面带负电荷,C0.5和C1样品表面由于更强的静电斥力而抑制细菌黏附,相反Ti样品表面则会黏附较多的细菌。因此,碳离子注入样品对细菌黏附的抑制作用被认为是其表面碳膜较大的化学惰性、较高的疏水性和较负的表面电位3种因素共同作用的结果(图9)。

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图9   C-PIII&D改性前后Ti表面细菌黏附机理示意图

Fig.9   Schematic of the possible bacterial adhesion mechanism on the titanium surface before and after C-PIII&D

2.3 体外生物活性评价

图10为小鼠成骨细胞MC3T3-E1在样品表面黏附与铺展的荧光显微镜照片。可以看出,经1 h培养,原始Ti表面及C-PIII&D改性Ti表面上的细胞均呈现为多边形,并且有少量伪足出现,说明细胞已经开始铺展;经4 h培养,细胞在各组样品表面的铺展情况均有明显改善,黏附、铺展情况良好;培养24 h的样品表面细胞的骨架明显,数量显著增加,说明成骨细胞在各组样品表面均能够很好地黏附和铺展。

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图10   小鼠成骨细胞MC3T3-E1在样品表面黏附与铺展的荧光显微镜照片

Fig.10   Fluorescence microscopy images of MC3T3-E1 cultured on various surfaces for 1 h (a1~c1), 4 h (a2~c2) and 24 h (a3~c3)
(a1~a3) Ti (b1~b3) C0.5 (c1~c3) C1

小鼠成骨细胞MC3T3-E1在材料表面的增殖活性测试结果如图11所示。可以看出,1和4 d后,改性前后各组样品表面细胞的增殖情况无明显差别;而培养7 d后,C-PIII&D改性Ti表面细胞的增殖率略高于纯Ti。上述结果表明,经C-PIII&D改性的Ti表面无细胞毒性,表现出良好的细胞相容性。

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图11   MC3T3-E1在样品表面的增殖活性

Fig.11   Proliferative activity of MC3T3-E1 cultured on various surfaces for 1, 4 and 7 d

3 结论

(1) 经碳等离子体浸没离子注入与沉积(C-PIII&D)处理,Ti表面可形成以无定形碳为主要组分的改性层。

(2) 经C-PIII&D改性,Ti表面的润湿接触角增大,表面负电性提升,表面力学性能和耐腐蚀性能得到提高。

(3) 经C-PIII&D改性,Ti表面显示出一定的抑制大肠杆菌黏附性能,改性样品表面的化学组成是影响细菌黏附的重要因素。

(4) 经C-PIII&D改性,Ti表面不呈现细胞毒性,表现出了良好的细胞相容性。

The authors have declared that no competing interests exist.