梁春永
, 郝静祖
LIANG Chunyong, HAO Jingzu
中图分类号: TB34
文章编号: 0412-1961(2017)10-1265-19
通讯作者:
收稿日期: 2017-07-3
网络出版日期: 2017-10-11
版权声明: 2017 《金属学报》编辑部 《金属学报》编辑部
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作者简介 梁春永,男,1976年生,教授,博士
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摘要
金属材料是医学植介入器件的主要应用材料之一,由于其具有离子溶出与生物惰性等缺点,因此如何提高植体表面的生物相容性与组织适配性成为金属生物材料领域的研究热点。在器件表面制备微纳结构,通过接触诱导机制对细胞及组织进行调控是改善金属植介入器件表面生物功能的重要研究方向之一。本文综合评述了金属植介入器件表面各种图案化微纳结构的制备技术与应用进展,并综述了接触诱导作用对成骨与血管内皮细胞、组织生长行为的调控以及对干细胞定向分化诱导等领域的研究进展。
关键词：
Abstract
Metal materials are one of the main application materials of medical implants. Due to the objective existence of the defects, such as ion dissolution and biologically inert, how to improve the biocompatibility and tissue suitability of the implant surface has attracted great research interests. Fabricating micro-nano structures on surfaces, which regulates the cell and tissue by the contact-induced mechanism is one of the most important research direction to improve the surface biological function of implantation device. In this paper, the preparation techniques and application progress of various microstructures on metal implanted devices surface were reviewed. In addition, the effects of contact induction on the regulation of osteogenesis to vascular endothelial cells, to tissue growth behavior and induction of stem cell differentiation were also reviewed.
Keywords：
医学金属植介入假体的广泛应用,解决了众多患者的病痛,成为骨科、心血管疾病治疗的一个重要手段。虽然金属材料具有良好的力学性能,在医学植入体中占据重要地位,但由于其离子溶出与生物惰性等缺点影响了术后的组织愈合,因而,提高医学植入材料的表面生物相容性及其与植入部位的功能适配性成为大家公认的热点研究方向。其中表面改性技术引入了物理、化学等学科的众多新方法,丰富了医学植介入假体表面改性研究的内容。
自从Harrison[1]发现表面结构影响细胞生长行为,并被Weiss[2]定义为“接触诱导”以来,通过接触诱导调控细胞的生长行为就成为一个研究热点。随着技术的进步,包括喷砂酸蚀、电化学处理、激光处理等在内的多种材料表面处理方法被应用于金属植介入材料的表面改性,人们研究了各种微米结构、纳米结构以及微米/纳米复合结构对细胞及生物组织生长的影响。图1[1-6]为医学植介入材料不同显微结构对细胞及组织接触诱导研究的发展历程。本文将从医学植介入材料表面处理方法及应用方向介绍金属植介入材料的接触诱导研究进展。
自从Harrison[1]发现表面结构对细胞生长行为的影响,包括最早广泛采用的简单机械划痕、喷砂工艺,乃至目前处于热点研究阶段的激光加工、离子刻蚀等技术手段在内的各种表面结构的制备方法,都被移植到生物材料的表面改性中,其中主要的表面处理方法如表1[7-127]所示。
表1 金属医学植介入材料接触诱导表面制备技术[
Table 1 Preparation methods of contact-induced surface of metallic medical intervention materials[
| Preparation method of contact-induced surface | Metallic medical material | Structural feature | Application effect | Application example |
|---|---|---|---|---|
| Mechanical grinding | Titanium and its alloy | Scratch structure of different scales[7-9] | Surface roughness increases, enforce the attachment of osteoblasts, induce to differentiate unidirectionally | Cell cultures experiments |
| Acid etching | Titanium and its alloy | Micron level structure: groove/ridge-valley/cellular[10-22] | Surface roughness increases, water contact angle decreases, promote osteointegration | Early implant |
| Sandblasting | Titanium and its alloy, alumina ceramics | Irregular deformation in micrometer size[23-31] | Surface roughness increases, promote osteointegration | Core-vent/Tubingen/Ankylos/Frialit-2 dental implant |
| SLA-etched | Titanium and its alloy | Irregular corrosion morphology in micrometer size[32-42,122,123] | Surface roughness increases, water contact angle decreases | ITI/Anthogyr dental implant |
| Anodic oxidation | Titanium and its alloy | Nanotube/nano pore arrays[43-58,124-127] | Water contact angle decreases, promote proliferation of osteoblast, promote osteointegration | Dental/femoral implant test in vivo |
| Micro-arc oxidation | Titanium and its alloy | Porous structure in micrometer/sub micrometer size[59-93] | Surface roughness increases, water contact angle decreases, active components loaded in situ | Dental/femoral implant test in vivo |
| Electron beam etching | Stainless steel | Crater structure[94-97] | Improve blood compatibility | |
| Ion etching | Titanium | Nano sized folded structures[98-102] | Adjust wettability, promote osteointegration | Dental implant test in vivo |
| Laser etching | Stainless steel, titanium and its alloy | Micron sized parallel striations/island structure, multi-structural compound[103-121] | Cells grow unidirectionally/selectively surface roughness increases, adjust water contact angle | Dental implant test in vivo, heart and brain vascular stent |
机械与酸蚀处理技术是最早被移植到金属植介入材料表面改性的方法,并成功地在现有种植体系统中实现了商业化。其中机械处理方法包括机械磨痕、喷砂等技术,通过物理手段使金属材料表面产生形变或磨损,从而改变材料的表面特征。机械磨痕法能够在材料表面加工出具有取向性的划痕结构,而喷砂利用高速喷射束能够在金属材料表面加工出不规则的微米级粗糙结构。相比之下,通过化学腐蚀的手段实现金属材料表面加工的酸刻蚀技术则能够在金属材料表面制备出具有微米级孔状、沟槽状/谷脊状等多种结构。图2[26,33,34]所示为几种不同方法所制备的典型显微结构。
图2 机械打磨、酸蚀处理、喷砂与喷砂酸蚀处理表面特征[
Fig.2 The surfaces patterns fabricated by mechanical grinding (a)[
机械处理能够显著提高材料的表面粗糙度,从而影响细胞的生长行为。Brunette[9]发现,Ti表面的机械划痕能通过接触诱导作用使细胞和胶原纤维沿机械划痕的沟槽定向生长和排列。Wennerberg等[26]用不同粒度的A12O3颗粒在光滑的纯Ti表面喷砂,发现砂体粒度越大,材料表面粗糙度越大。Bowers等[25]研究发现,喷砂处理获得的不规则粗糙表面更有利于细胞的黏附。Ti植入体经喷砂之后获得的粗糙表面可以促进上皮细胞及成纤维细胞的早期附着,进而提高种植体界面的骨结合强度,加快种植体早期固定并增加长期服役的成功率[28]。卢保全等[27]将喷砂处理后的纯Ti牙种植体进行体内植入,经24~32个月的随访观察,种植体无一例失效。有实验[28]证实,与机械处理后的种植体相比,用羟基磷灰石(HA)颗粒进行喷砂处理后的种植体的骨结合能力较高,且与使用其它种类砂粒处理后的种植体的骨结合能力相似,此外,种植体上残留的羟基磷灰石还可促进骨组织与种植体的骨性结合。另外,有研究[122]表明,经过Ti颗粒喷砂的种植体,临床植入10 a后较光滑表面的种植体具有更高的成功率。
酸蚀技术通过具有强腐蚀性的酸(如HCl、H2SO4、HNO3、HF等)蚀刻材料表面,所得表面结构形貌为具有一定形状和大小的蚀坑,通过调控腐蚀工艺,能够获得不同尺度的孔洞、沟槽/谷脊等结构。酸蚀处理形成的孔洞结构提高了植入材料的表面粗糙度,增加了植入体与组织的界面面积,进而促进细胞生长与组织愈合。Zhang等[15]研究了采用HNO3-H2O2溶液刻蚀的Ti表面(EB)与用H2SO4-HCl刻蚀的Ti表面(ED)对成骨细胞生长的影响,结果发现EB样品更有利于成骨细胞的黏附、增殖与矿化。Klokkevold 等[16]通过白兔体内实验证明,酸蚀处理能够增强骨与植入物的结合力,同时能够促进其早期骨整合行为。Daugaard等[18]也证明,经过酸蚀处理的Ti植入体与骨组织间纤维组织减少,这促进了骨组织生长和种植体骨界面的骨生成。Abrahamsson等[17]通过动物实验证明,酸蚀处理后的表面与骨组织形成了更好的骨结合。Balloni等[19]分析了酸蚀处理和机械划痕对间充质干细胞(MSCs)的影响,结果发现酸蚀处理表面更有利于MSCs的成骨分化。
喷砂和酸蚀技术虽然均增大了种植体表面积,但是喷砂易造成形貌不规则,并且具有大量的锐利边缘及Ti表面内应力分布不均,还可能造成Ti表面异种元素的污染(砂粒嵌入),而酸蚀技术难以获得几十微米尺度的粗糙结构,为此,人们将喷砂技术与特定的酸蚀处理相结合,以改善植入体的生物学性能。Chiang等[34]根据体外实验结果认为,经过喷砂酸蚀处理(SLA)的表面和骨之间具有互锁的能力。Martin等[41]在研究不同喷砂酸蚀工艺下钛合金表面对细胞生长的影响时认为,材料表面的粗糙度对成骨细胞的生长、增殖和细胞外基质分泌均存在影响,同时还可能在细胞表型的表达中发挥一定的作用。Chiang等[34]在SLA样品表面通过电化学处理制备出一层具有良好亲水性的TiO2薄层,与单独的喷砂或者酸刻蚀处理相比,进一步提高了植入体的生物相容性。Herrero-Climent等[35]的研究认为,喷砂和酸蚀的结合加速了不同时期的骨再生。李德华等[36]对喷砂酸蚀这一粗化技术做了一系列体外及体内的实验研究,证实了改良喷砂表面处理在Ti牙种植体中应用的可靠性,认为改良喷砂表面处理所获得的粗糙表面可以大大地提高牙种植体骨界面的结合强度,有利于牙种植体的骨愈合,并形成骨纤维垂直连接式的骨结合,还从细胞学角度证明喷砂酸蚀表面具有加快种植体骨愈合的作用。
目前,瑞士的Traurnman口腔种植体系统(SLA/SLActive)、德国的Ankylos系统等一些世界著名品牌的种植体已采用了喷砂酸蚀的表面处理方法,这些系统在临床上获得了良好的应用效果,进一步缩短了口腔种植的临床治疗时间[37]。虽然喷砂酸蚀的表面处理方法具有许多优点,但其喷砂操作的不可控性会导致材料表面的结构不稳定,进而影响其对细胞生长的促进作用;此外,酸蚀处理过程也未能完全去除表面嵌入的杂质颗粒(如A12O3等),从而影响骨结合。SLA的这些不足促使科研工作者们继续深入研究改进的SLA方法或其它类型表面处理技术在医学植入体表面改性中的应用。
电化学处理技术是将待处理表面置于阳极,使其在电场作用下发生化学反应,形成与化学刻蚀不同的表面结构的处理方法,其早期主要用于多孔Al2O3膜的制备研究。1970年,松下电器首先在美国获得了将阳极氧化技术用于Ti及其合金表面氧化膜制备的专利授权[124]。随后,对于Ti及钛合金阳极氧化制得的表面TiO2孔结构层的报道也逐渐出现。2001年,Grimes教授领导的科研小组[56]首次成功制备出了TiO2纳米管阵列,这之后的多年内,采用阳极氧化方法在Ti及钛合金表面制备多孔结构[47-50]依然吸引着人们的关注。随着对TiO2纳米管阵列的研究越来越深入,应用越来越广泛,其相对于多孔结构的优势也越来越明显,研究热点也更多地集中在TiO2纳米管阵列的制备上。2005年,Cai等[51]考察了恒压条件下电解液pH值、离子组成及离子浓度对自组装TiO2纳米管阵列的影响,获得了阳极氧化制备TiO2纳米管阵列的参数及工艺。近几十年来,阳极氧化作为一种电化学自组装制备纳米结构的方法,发展异常迅速,采用阳极氧化法在金属表面获得的多种纳米结构包括纳米孔、纳米管和纳米坑等,如图3[53,54,128]所示。
图3 利用阳极氧化法在金属表面加工出的不同纳米结构[
Fig.3 Different nano-structures on metal surfaces processed by anodic oxidation method; including kinds of tubes (a[
近年来的研究发现,TiO2纳米管也具有良好的生物相容性,其在生物医用领域的研究也有了一定进展。2005年,Oh等[129]发现,TiO2纳米管阵列经NaOH溶液处理后其生物活性增强,在模拟体液中加快了羟基磷灰石在其表面的生长速率,该特性使得TiO2纳米管阵列有望在整形外科与牙齿移植中得到应用。2007年,Popat等[130]采用HF水溶液在纯Ti表面制备直径为80 nm、长度为400 nm的TiO2纳米管阵列,并在阵列表面对MSCs细胞进行了培养,经过7 d的培养,在该纳米管阵列表面上MSCs细胞的增殖、碱性磷酸酶(ALP)基因的表达和钙磷的矿化能力均明显高于初始Ti表面。目前,已有较多研究者探索了TiO2纳米管在骨组织修复与替换中的应用,考察了成骨细胞与TiO2纳米管的接触反应。Li等[46]的研究发现,内径约为70 nm、管壁厚为20 nm 以及管长为250 nm 的锐钛矿型TiO2纳米管具有较好的促成骨细胞生长作用,细胞丝状伪足可延伸至纳米管内形成机械锁合,有利于骨结合。Yu 等[131]评价了小鼠成骨前体细胞(MCT3T)在系列管径尺寸的TiO2纳米管表面黏附、增殖和分化,研究显示,经 450 ℃热处理3 h得到的管径为20~70 nm锐钛矿型纳米管表面有利于细胞的黏附,ALP活性较高;Brammer等[132]研究表明,管径70~100 nm 的纳米管表面细胞数量较少,但具有拉长的细胞形态和较高的ALP活性。采用Lewis 鼠模型评价TiO2纳米管的组织相容性表明,TiO2纳米管植入体周围未观察到纤维组织形成,体现出良好的组织反应[130]。将TiO2纳米管和喷砂处理Ti材在兔模型中的组织反应进行对比发现,纳米管植入体具有较好的骨结合能力[133]。猪体内植入对比研究发现,TiO2纳米管能刺激新骨的形成,周围组织中的I型胶原表达量升高[134]。此外,Wang 等[135]研究猪植入体动物模型的结果表明,TiO2纳米管能刺激骨生成相关基因的表达,管径70 nm 的TiO2纳米管表现出较佳的成骨细胞分化和骨基质生成的能力。
微弧氧化(micro-arc oxidation,MAO)又称等离子微弧氧化或者微等离子体氧化,是一种在阳极氧化的基础上发展起来的表面改性技术。微弧氧化技术将阳极的工作电压升高,突破Faraday区域,使金属表面出现火花放电现象,同时将阳极氧化中电源采用的简单直流模式改为交流或者直流脉冲模式,实现对阳极附近的阴、阳离子比例的有效控制,从而获得特定的表面显微结构。此外,高压下的脉冲电流还可以使膜层表面的微孔重叠在一起,形成厚度均匀的膜层,从而得到更加平整、致密、结合强度更高的氧化膜。与阳极氧化相比,利用微弧氧化技术得到的陶瓷层大大提高了金属表面的强度、耐磨性、耐腐蚀性和高温抗氧化性,同时还具有电绝缘性,通过调整电解液组分和改变工艺条件,可以实现对陶瓷层结构和组分的设计[63,64]。图4[64,136]列出了常见微弧氧化陶瓷层的表面形貌。
图4 微弧氧化后Ti的氧化物表面和电解液中引入钙磷后的Ti表面[
Fig.4 Surface morphologies of titanium treated by micro-arc oxidation
(a, b) titanium oxide surface[
(c, d) titanium surface after the introduction of calcium and phosphorus in electrolyte[
早在2004年,Li等[65]就采用Ca(CH3COO)2H2O和CaC3H7O6P的混合液作为电解液,在190~600 V范围内在纯Ti表面制备出从几微米到十几微米厚的多孔陶瓷层,该多孔层中富含Ca、P元素,人骨肉瘤细胞(MG63)在该多孔陶瓷层上培养7 d后,其细胞数目增长为原来的10倍,且ALP活性与制备多孔陶瓷层所用电压有关,低电压下得到的陶瓷层对ALP的活性并没有明显影响,当电压达到300 V以上时,ALP的活性随电压升高而迅速上升。2005年,Dong等[66]在Ti6Al4V表面制备出了含Ca、P的孔径为1~2 μm的具有锐钛矿、金红石和氧化钒的混合相多孔陶瓷层。同年Liu等[137]制备出了Ca/P含量比可调节的4 μm厚的多孔陶瓷层,结果表明,电压为350 V时制得的 多孔陶瓷层中Ca/P含量比为1.68。2006年,Chen等[138]选用NaH2PO4为磷源,一步实现了羟基磷灰石在多孔陶瓷层中的原位沉积。此后,有关微弧氧化制备多孔陶瓷层同时原位引入钙磷相的报道还有很多。这些报道中,钙磷相的引入或是通过微弧氧化工艺的调整一步原位引入的,或者是通过后续步骤转化或矿化形成的,比如热处理、水热处理[139,140]或者模拟体液(SBF)浸泡等手段。随着新型钛合金的开发,也出现了将微弧氧化用于NiTi、Ti-3Zr-2Sn-3Mo-25Nb、Ti-24Nb-4Zr-7.9Sn等新型钛合金制备多孔陶瓷层的报道[59-62,141],其生物学性能上的改进与应用于传统的纯Ti及Ti6Al4V上所得到结果十分类似,所形成的陶瓷层具有良好的血液相容性,且对成骨细胞的黏附和增殖有良好的促进作用,动物体内实验中也表现出了优秀的骨结合能力。
细菌感染是医学植入失效的重要因素之一,因而具有抗菌能力的植入体在医学领域具有一定的优势,而电化学工艺制备的表面由于具有纳米孔、纳米管等结构可以作为抗菌剂的良好载体。2007年,Popat等[57]在TiO2阵列表面成功装载了庆大霉素,发现装载了庆大霉素的TiO2纳米管阵列表面可大幅降低葡萄球菌的吸附量,同时具有明显的促进MCT3T细胞生长以及促进ALP基因表达的作用。2009年 ,Song等[142]通过在微弧氧化电解液中添加Ag+和Pt+,一步法在多孔陶瓷层中掺杂Ag和Pt,额外赋予了陶瓷层抗菌能力。2015年Li等[143]也将Ag负载于阳极氧化TiO2纳米管中,使植入体获得了良好的抗菌能力。
电化学处理通过表面氧化层的制备,不仅获得了利于生物细胞黏附促进组织生长的纳米多孔显微结构,同时能够通过电解液的调控使植入体表面获得具有更好的生物相容性或抗菌性。另外,还有研究[10,144,145]表明,这种氧化层的获得,有利于提高植入体的耐腐蚀性,进而减少植入体中的金属离子溶出,降低其细胞毒性。然而,对于生物组织,其结构通常包含了从纳米到微米甚至到毫米的多级结构,电化学处理技术在较大尺度仿生结构的制备方面存在一定的局限性。
刻蚀技术是指通过光束、电子束或离子束加工材料表面,获得具有较规则的显微结构。根据所用能量源的不同可以分为电子束刻蚀、离子束刻蚀以及激光束刻蚀等。
张可敏等[94,96,97]和林奕桢[95]研究了电子束刻蚀对生物材料表面的影响,发现电子束刻蚀能在材料表面形成熔坑或火山坑状结构,提高了材料的亲水性和血液相容性,有利于Ca、P元素的沉积。Riedel等[102]通过离子束刻蚀技术在Ti表面制备了粗糙的微米结构和周期排列的纳米条纹结构,发现刻蚀的表面更有利于间充质干细胞向成骨方向分化。他们还在Ti表面制备出了针状结构,发现离子束与表面法线方向成75°角时能够诱导细胞沿所形成的针状方向伸展,而当该角度为30°时,形成的针状表面则抑制细胞的扩展。研究[101]还表明,在Ti6Al4V表面O2-刻蚀形成的粗糙表面和氧化层能够促进凝血,该结果显示离子束刻蚀表面有助于植入术后的止血,减少术后出血量。Moon等[99]的研究也发现,通过离子束刻蚀在Ti6Al4V表面制备的微米/纳米多级粗糙结构更有利于促进成骨细胞黏附,提高骨组织结合面积。
由于离子束或电子束的传播特性,离子束刻蚀和电子束刻蚀通常要求在真空环境下进行,提高了其生产成本和操作难度。相比之下,激光束刻蚀可以在空气甚至液体环境下进行,因而具有更好的可操作性和低成本。同时,激光束刻蚀技术具有喷砂酸蚀等表面处理技术不具备的非接触的特点,加工过程中完全避免了材料表面与化学溶液、涂敷物质、机械工具等的直接接触,因而避免了因物质残留或涂敷层脱落对植入体表面生物相容性的影响[110-112,121]。
激光束刻蚀可分为激光光刻技术和激光直写技术。激光光刻技术通过两束光的干涉,形成干涉光斑照射涂敷在基体上的光刻胶,使光刻胶按照干涉光斑的照射固化,然后将未固化的光刻胶清洗掉,从而形成光刻胶的图案结构,再通过腐蚀技术将没有光刻胶的部分进行腐蚀,最后将固化的光刻胶清除,就在材料表面获得相应的图案结构。该技术通常被用于半导体行业Si基底的刻蚀,由于其能够制备纳米到微米级的规则结构,因而有科研工作者采用该方法在Si片或聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)等高分子材料表面制备了多种图案结构,探讨了其生物学性能[146-151]。也有科研人员在金属表面直接制备光刻胶的图案,或者制备光刻胶图案后再制备金属表面涂层,获得金属表面图案。Ballo等[152]和de Peppo等[153]在胶体光刻植入体表面溅射了一层Ti金属涂层,发现通过胶体光刻技术与金属涂层技术的结合,可以获得有利于细胞黏附、生长的显微图案结构,诱导组织再生,提高植入体的骨结合率。
光刻技术虽然能够获得多种规则的图案结构,但是其制备过程复杂,控制难度高。而激光直写技术就要简单很多,该技术直接采用高功率密度的激光照射材料表面,使其迅速熔融、气化,实现材料表面物质的去除,进而获得相应的表面图案结构。20世纪末及21世纪初,研究者主要利用脉宽较长的纳秒激光和皮秒激光在生物材料表面制备不同尺度与形状的结构,早期的研究主要集中在牙科的Ti种植体。Gaggl等[110]在2000年报道了激光束刻蚀、喷砂、离子喷涂与机械打磨等处理方法对Ti种植体植入效果的对比,认为激光束刻蚀制备的表面获得的表面污染最小、结构最理想。类似地,Joób-Fancsaly等[121]发现,与TiO2涂层、喷砂与机械打磨等技术相比,激光束刻蚀在制备具有特殊微结构和高洁净度的植入体表面方面具有明显优势。Pető等[111]和Karacs等[112]利用激光处理Al2O3喷砂后的Ti牙种植体表面,得到了全新的微结构并有效提高了植入体表面洁净度。Trtica等[154]利用波长分别为1064和532 nm的皮秒激光处理Ti植入体表面,发现1064 nm激光刻蚀处出现了飞溅液滴冷凝形成的颗粒,而532 nm激光照射处出现波纹结构。Hallgren等[155]利用激光在牙种植体表面制备微米孔阵列以增加种植体表面积与粗糙度,动物实验发现其促进牙种植体植入后的周围骨组织生长。
随着激光技术的进步,脉宽更短的飞秒激光也开始被用于植入体表面的处理。飞秒激光加工的优势在于更小的热影响区和更好的加工精度。2007年,Vorobyev和Guo[156]采用飞秒激光刻蚀了Ti表面,对不同参数飞秒激光制备的不同尺度和形状的表面结构进行了众多尝试,得到了丰富的结构。2008年,本文作者课题组[157,158]证明飞秒激光处理的Ti植入体表面比喷砂酸蚀表面更有利于钙磷盐的沉积。随后,众多研究者利用不同参数飞秒激光在多种金属材料表面制备出了各种尺度和形状的显微结构,并用于医学植介入材料的表面改性。Nayak等[159]在Ti表面得到尖锥结构, Bizi-Bandoki等[118]研究了单点脉冲数量对316L不锈钢表面微纳复合结构的影响。2009年 Ilgner等[145]采用飞秒激光在Ti表面制备的微结构促进了耳软骨细胞在样品表面的黏附与增殖。2010年本文作者课题组[119]采用飞秒激光照射浸入模拟体液或HA悬浮液中的纯Ti表面,获得了微米级的沟状、岛状、孔洞和纳米条纹与颗粒组成的复合微结构,并诱导Ca、P元素在样品表面沉积,细胞实验证明加工过后的材料表面有利于成骨细胞在其上更快的附着与生长。Symietz等[120]也发现,通过飞秒激光处理黏附HA胶体的Ti表面,能够在获得表面微结构的同时将HA负载于样品表面。研究[6,113-115]表明,飞秒激光技术在钛合金、镁合金等材料表面制备的仿生结构能够改善材料表面的生物学性能并对特定细胞的生长具有明显的接触诱导作用。2013年,本文作者[116]通过动物体内实验证明飞秒激光处理Ti植入体能够促进早期骨结合,提高植入早期植入体与骨组织的结合力。2015年,本文作者[117]发现飞秒激光不仅能够诱导溶液中的Ca、P元素在Ti表面沉积,同时也能够诱导胶原等生物大分子在金属表面沉积,为医学植入材料表面生物活化提供了一种新的思路和方法,如图5[117]所示。2016年,本文作者[160]又采用飞秒激光在血管支架表面制备了仿生图案结构,发现其能够诱导血管内皮细胞定向生长,并促进支架植入后的内皮化。
图5 飞秒激光诱导胶原沉积：飞秒激光加工的“中”字、胶原免疫荧光显色、飞秒激光诱导胶原的显微结构[
Fig.5 Femtosecond laser-induced collagen deposition[
(a) the "中" character processed by femtosecond laser
(b) immunofluorescence color of Collagen
(c) the microstructure of collagen induced by femtosecond laser
刻蚀技术通过刻蚀工艺调整,能够在材料表面获得从纳米到微米级的各级显微结构,特别是飞秒激光直写技术,能够通过工艺调整一步获得具有多级粗糙结构的显微表面,在多级结构接触诱导仿生表面的制备中具有明显的优势。同时,有研究[161]认为,激光处理表面具有较好的耐腐蚀性,从而减少金属离子溶出对细胞生长的危害。然而,与电化学处理等方法相比,刻蚀技术所采用的设备昂贵、维护成本较高、加工效率相对较低,限制了其在医学植介入器件接触诱导仿生表面制备中的应用。
目前,多种方法被应用于生物医学材料的表面改性,这些方法各有优缺点。随着各种表面改性技术的日趋成熟,不同方法之间交叉联用逐渐成为了研究的热点。Wei和Zhou[162,163]在对多孔陶瓷层进行热处理之前,先进行了一步化学处理,发现多孔陶瓷层、化学处理后的多孔陶瓷层以及热处理后的多孔陶瓷层三者的表面粗糙度呈上升趋势,经SBF溶液浸泡后,MG63细胞培养结果显示,化学处理后的多孔陶瓷层具有相对较好的促进细胞增殖的能力,复合方法的优势得以体现。姚再起等[164]将喷砂技术与微弧氧化技术联用,制备出了含有更高Ca/P质量比的多孔陶瓷层,且由于前期喷砂工艺的实施,使得微弧氧化过程中,粗糙的喷砂表面的氧化速率分布不均匀,最终实现多孔陶瓷层与基体的机械咬合,从而提高了结合强度。这种复合技术的应用,将为生物医学植入材料表面接触诱导仿生带来新发展与进步。
针对表面接触诱导结构及植入体应用领域的不同,接触诱导作用对细胞生长行为影响的研究主要集中在骨植入体、血管支架以及干细胞诱导分化等方面。
自20世纪以来,骨植入就成为骨组织损伤修复及替代的重要手段,目前金属植入体由于其良好的力学性能仍然是骨植入体的主要产品。然而由于金属的生物学惰性甚至是微弱的生物毒性影响了术后的骨组织愈合,因而,植入体的表面改性成为改善骨植入体生物学性能、促进植入体术后组织愈合的重要研究方向。随着医学的进步及细胞接触诱导行为的研究,人们发现,材料表面显微结构对成骨细胞的黏附、增殖存在明显的影响[165],因而研究了显微结构对骨细胞及骨组织生长行为的影响[58]。“接触诱导”效应能够通过表面结构的作用影响成骨细胞的生长行为,并且能够与表面化学涂层相复合以促进成骨细胞的生长、矿化,从而成为骨科植入材料表面生物活化的一个重要方法。随着技术的发展,人们将材料的表面加工方法逐步应用于骨植入体的表面改性,包括机械磨痕、喷砂后酸蚀、电化学处理、激光加工、离子束刻蚀等表面微结构的制备技术均被应用于骨植入体的表面改性。
Thomas和Cook[166]通过喷砂处理纯Ti等材料表面发现,粗糙表面比光滑表面更有利于骨组织结合以及成骨细胞黏附、增殖与矿化;同时通过体内实验研究也证明,在粗糙的Ti表面成骨细胞会形成更多的初始黏附。Wennerberg 等[23]研究发现,当表面粗糙度(Ra)达到1.5 μm时植入体与骨组织的锁合力最大。喷砂酸蚀技术能够在材料表面制备出不规则的微米级粗糙结构,提高材料表面粗糙度,从而促进细胞的黏附、增殖,目前已成为多种商业骨植入体的表面处理方法[167]。Huang等[8] 和Park等[14]通过机械磨痕法在材料表面制备出定向的划痕结构,发现该结构不仅有利于成骨细胞黏附,还可诱导其沿划痕定向生长。研究中人们发现,细胞的伪足等结构均为纳米尺度结构,为此,科研工作者采用电化学处理、离子束刻蚀等方法在金属植入体表面制备了纳米仿生结构图案,以提高成骨细胞在植入体表面的黏附性能[168]。研究发现,通过阳极氧化法与微弧氧化法在Ti植入体表面制备的纳米管、纳米孔等结构有利于HA的矿化沉积[169],促进成骨细胞生长[50],并促进骨组织愈合[170]。通过紫外线辐照或者在电化学处理过程中诱导Ca、P元素在多孔表面沉积有利于进一步提高植入体的生物相容性[171,172]。离子刻蚀技术能够在材料表面刻蚀出规则的条纹、孔洞等结构[173]。研究[173]表明,离子刻蚀所制备的规则结构同样能够促进细胞的黏附、增殖,且当条纹结构的尺度在约为1000 nm时能够对细胞的生长方向产生重要的诱导作用,从而使细胞沿条纹结构方向生长(图6[174])。Cai等[175]研究发现,溅射法制备的纳米Ti薄膜对细胞的生长并没有促进作用,表明过小的粗糙度和纳米结构尺寸对细胞的生长并没有显著的影响。
图6 不同尺度离子刻蚀结构对成骨细胞生长的诱导作用(图中箭头方向为条纹结构方向)[
Fig.6 The contact-induction of the Osteoblast by different sizes of ion etching structure; the patterns periods are 1000 nm (a), 300 nm (b) and 200 nm (c) (Arrows indicate the groove directions)[
对于生物骨组织,其中存在从纳米级到微米级的多级显微结构,目前人们致力于设计、制备具有多级仿生结构表面的骨植入体。Wang等[176]通过酸刻蚀后阳极氧化法在Ti基体上制备出了由微米凹坑和纳米管组成的显微图案表面,发现该表面有利于类骨磷灰石的矿化沉浸,促进成骨细胞的黏附与增殖。Necula等[177]通过等离子喷涂Ca3(PO4)2和羟基磷灰石涂层后进行微弧氧化,获得了由不规则的微米结构和纳米孔组成的显微结构。Ajami等[178]通过喷砂后进一步采用纳米HA处理获得了微米/纳米复合表面,动物体内研究表明,该表面有利于早期骨组织在植入体表面的锚接。本文作者前期工作[6]通过飞秒激光直写技术在纯Ti及钛合金植入体表面制备了由微米沟槽、亚微米条纹及纳米颗粒组成的多级仿生结构(图7[6]),并诱导钙磷盐在植入体表面原位沉积,有效促进了其成骨细胞的黏附及骨结合能力,显著提高了植入早期植入体与骨组织的结合力。
图7 不同激光通量下飞秒激光直写技术在Ti合金表面制备的多级粗糙结构[
Fig.7 Low (a~c) and high (d~f) magnified hierarchical structures prepared by femtosecond laser technology on Ti alloy surface under femtosecond laser fluxs of 1.27 J/cm2 (a, d), 2.55 J/cm2 (b, e) and 3.82 J/cm2 (c, f)[
医学骨植入作为众多骨科疾病治疗的重要手段之一,骨科植入体的生物学性能决定了患者术后的恢复与组织愈合。“接触诱导”的研究为新型医学植入体的开发提供了新方法,新型促骨生成医学植入体的应用将有利于促进患者术后的康复与生理功能恢复,改善患者的生存质量。
自1987年Sigwart等[144]首次报道了血管支架以来,血管支架植入术就成为冠心病治疗的重要手段之一。金属支架植入血管时,支架撑开血管内腔,从而保证血流的通畅。然而,撑开的支架将造成血管内壁的损伤,导致血管平滑肌细胞大量增殖,进而在这些损伤位置出现再狭窄,危及到患者的生命安全。研究[179]表明,在血管支架表面原位生长血管内皮细胞可以增加支架的血液相容性,减少平滑肌细胞导致的再狭窄。如果新植入的支架表面迅速被内皮细胞覆盖,将会限制平滑肌细胞的增生,从而提升血管支架的治疗效果。此外,作为生物惰性的金属材料长期存在于血管中,易于诱发血管内的非细菌性炎症等问题,从而诱发远期再狭窄。为了获得药物涂层的控制释放效果以达到长期抑制平滑肌细胞增生造成的再狭窄问题,人们尝试在金属支架表面制备多孔结构用于药物的装载和控制释放,开发了从纳米级到微米级的孔洞结构用于药物的负载和控制释放[180]。在此基础上,人们发现,支架的表面结构对内皮细胞的生长行为同样存在一定的接触诱导作用,于是科研工作者研究了显微结构对血管内皮细胞、平滑肌细胞生长的影响。因此,支架表面显微结构对内皮细胞生长的选择性接触诱导成了除药物涂层之外抑制平滑肌细胞增殖的另一重要手段。为了在血管支架不足100 μm的网格表面获得不同的显微结构,科学工作者开发了多孔涂层及支架表面直接制备显微图案工艺以促进支架表面的快速内皮化[181]。
表面结构对内皮化的接触诱导研究主要分为2类：一类是制备纳米孔或管类结构;另一类是制备沟槽或条纹类结构。纳米孔或管类结构制备的初衷仍是为了研究药物的装载与控释,研究过程中,人们发现此类结构对细胞的生长存在一定的影响。为了获得多孔结构,通常采用Ti等能够获得阳极氧化孔的基材或涂敷一层有利于获得孔结构的涂层。Peng等[182]采用阳极氧化法在Ti表面制备了直径约为30 nm的TiO2纳米管结构,并研究了其对血管内皮细胞和平滑肌细胞生长的影响,结果表明,与光滑表面相比,纳米管结构能够促进血管内皮细胞的黏附、增殖,从而抑制平滑肌细胞的生长。材料表面纳米结构的获得有利于血管支架植入后的再内皮化,从而抑制支架内再狭窄的发生。等离子沉积(ionic plasma deposition,IPD)同样是材料表面改性的方法之一,采用这种技术可在材料表面制备厚度小于100 nm的纳米薄层,进而改变材料表面的生物相容性[183]。Pareta等[184]采用等离子沉积方法在金属(商业纯Ti及Ti6Al4V)及聚合物(聚氯乙烯 PVC、聚氨酯 PU、聚四氟乙烯 PTFE、聚对苯二甲酸乙二醇酯 PETG及尼龙 NYLON)表面制备了纳米Ti层,并深入探讨了其对内皮细胞的黏附作用,结果表明,等离子沉积后的材料表面粗糙度有所增加,并提升了内皮细胞在材料表面的黏附作用。Mohan等[185]采用碱性水热处理方法在纯Ti表面制备了具有多种纳米TiO2微观结构的表面形貌,这些不同的微观结构对血管内皮细胞和平滑肌细胞表现出不同的作用,可以看出,表面处理后的Ti片对人体血管内皮细胞的生长具有一定的促进作用,其中纳米片层结构最为显著,相比之下,这些纳米微观结构对血管平滑肌细胞具有明显的抑制作用,因此有利于提升血管支架的使用寿命及可靠性。
沟槽或条纹结构同样可以促进血管内皮细胞的增殖过程,这类结构可通过光刻蚀、离子束刻蚀、激光直写等方法获得。Lu等[186]通过等离子刻蚀技术在纯Ti表面制备了宽度750 nm到100 μm不等的沟槽结构,并研究了不同的图案结构对内皮细胞黏附及生长的促进行为,结果表明,宽度为750 nm的沟槽结构更有利于血管内皮细胞的黏附,且宽度为750 nm~5 μm的微观条纹结构均能够诱导血管内皮细胞形成类似自然细胞的定向排列生长。
Li等[187]同样在Ti片表面制备了由25 μm宽的高分子量透明质酸和25 μm宽碱处理Ti沟槽组成的结构,研究了血管内皮细胞与平滑肌细胞在该结构上的生长行为,结果表明,沟槽结构有利于诱导平滑肌细胞与血管内皮细胞沿沟槽方向定向生长。Oberringer等[114]研究了飞秒激光加工的点状阵列对316L不锈钢表面成肌纤维细胞生长的影响,其显微结构为直径数十微米的激光加工光斑,光斑中心形成由微米级凹坑和条纹、颗粒等组成的微米到纳米多级结构,结果表明,在不同密度阵列表面,成肌纤维细胞的生长受到抑制,且随阵列密度升高,细胞密度降低。本文作者前期工作[160]通过飞秒激光微加工技术在血管支架表面制备了类平滑肌细胞表面的条纹结构,发现该结构能够促进支架植入术后的内皮化,进而防止再狭窄的发生,如图8[160]所示。
图8 血管平滑肌细胞(VSMC)的表面结构和飞秒激光加工表面图案及其对应的轮廓线[
Fig.8 The surface structure of the vascular smooth muscle cell (VSMC) (a) and the corresponding surface pattern machined by femtosecond laser (c), and the line profiles of the white dash lines in
总体来说,与骨植入体相比,由于血管支架的结构限制,关于金属支架表面结构对内皮细胞生长的接触诱导研究较少,且仍主要局限于平面样品,少量的研究在血管支架表面制备了诱导图案,但相关技术仍不成熟,该领域的研究在实际产品中的应用还有待相关技术的进步与设备开发。
自上世纪70年代干细胞被发现以来,干细胞治疗逐渐成为一种新型、特效的治疗方法。干细胞能够分化成多种组织细胞,并具有分化为某些组织的潜能[188,189],在治疗神经系统、循环系统等多种系统的各种疾病方面得到应用,且比很多传统治疗方法具有无可比拟的优点。一方面,干细胞培养是干细胞治疗的先决条件,因而获得有利于干细胞生长的微观结构具有重要的意义;另一方面,医学植入体植入人体后,干细胞与植入体表面接触,需要向特定的组织细胞进行分化,材料的表面状态对干细胞生长与分化行为存在重要影响[190]。Bigerelle等[191]研究认为,当材料表面粗糙度与细胞尺寸接近时不利于干细胞的黏附,而当粗糙度远大于或远小于细胞尺寸时,细胞能够有效地黏附于样品表面。有研究[190]表明,材料表面的图案结构对干细胞的分化行为起到重要的诱导作用。材料表面结构使细胞骨架产生应力,该信号被细胞某些受体所感应,使其被激活,释放或减少某些生物因子,引起细胞骨架重组,细胞便会调整自身方向。通过该过程调节细胞的张力和压力,从而达到整体的力学平衡[192],不同结构的微纳结构表面还可以改善材料的物理微环境,干细胞可以感受不同外部环境下的机械刺激,从而激活特定的表面受体,引起相关基因的表达量增加,影响干细胞的活动,促进了其向特定组织细胞的分化[193]。
神经细胞是干细胞的分化研究的主要目标之一。由于神经细胞是一种高度分化的细胞,其自身增殖能力很弱,靠神经细胞的自身增殖难以获得足够的神经修复用细胞,因而科研工作者开展了关于神经祖细胞、间充质干细胞(MSCs)等具有分化潜力的干细胞向神经细胞分化的研究。Recknor等[194]和Chan等[195]均发现,在沟槽类结构表面,干细胞能够更好地分化为神经细胞并形成定向排列。Jiang等[196]发现,纤维状结构同样有利于干细胞向神经细胞分化。由于神经细胞分化的目的和神经修复材料的特点,关于干细胞分化为神经细胞的研究主要在高分子基体上进行,金属表面对神经细胞分化影响的研究较少。骨及心血管支架等医学植入体进入人体后,其表面将会黏附干细胞,干细胞根据周围环境特点分化为相应的组织细胞,为此,人们研究了不同的表面图案结构对干细胞分化为相应组织细胞行为的影响。
MSCs是一种具有众多分化方向的多能干细胞,且因大量存在于成人骨髓中而受到关注[197,198]。更重要的是,它能够分化为在骨组织修复中最为重要的成骨细胞,因而促使MSCs定向分化为成骨细胞成为研究的重点之一,而接触诱导为促进MSCs定向分化为成骨细胞提供了重要思路[190,199]。Valencia等[200]对比了喷砂和喷砂酸蚀处理Ti表面对MSCs的影响,发现喷砂酸蚀处理表面更有利于干细胞的黏附、生长及成骨分化。Naddeo等[201]分析了喷砂酸蚀处理和氧化处理Ti种植体对MSCs分化的影响,结果表明,喷砂表面更有利于种植体的成骨分化,而氧化表面更有利于细胞的增殖。Zhang等[202]通过C2H2O4与H2O2处理Ti表面制备了微米/纳米复合结构,发现其更有利于MSCs的黏附并促进其向成骨细胞分化。Chen等[203]研究发现,飞秒激光制备的多级结构表面有利于诱导干细胞定向生长并促进其成骨分化,如图9[203]所示。
图9 干细胞在不同结构表面的响应[
Fig.9 The response of stem cells to different structural surfaces[
血管支架植入后,金属支架表面与人体血液接触,血液中的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)在支架表面黏附并分化为内皮细胞,从而实现支架表面的内皮化,恢复血管内壁功能,因而干细胞诱导分化内皮细胞成为重要的研究方向之一。Moradi等[204]在阳极氧化处理的多孔Ti表面培养EPCs,发现该表面有利于EPCs的黏附与增殖。Ziebart等[205]分析了EPCs对酸蚀、喷砂后酸蚀等表面的响应,结果发现,EPCs在喷砂酸蚀表面具有更高的血管内皮生长因子(VEGF-A)等蛋白的表达量,表明该表面更有利于EPCs的内皮分化。MSCs在人体内含量较多,因而一些科研工作者研究了其向内皮细胞分化的行为。Kukumberg等[206]在具有不同结构的Si片表面培养MSCs,发现直径1.8 μm的凹面镜结构更有利于MSCs定向分化为内皮细胞。
仿生结构调控干细胞分化的研究不仅为体外获得更多优质的组织细胞提供了新的思路与方法,同时也为植介入器件术后的组织愈合提供了理论依据与参考,新型调控干细胞定向分化的医学植介入器件将有效提高医学植入患者的康复速度,改善患者生活质量。
金属材料在医学植介入领域具有重要的作用,但其生物惰性甚至弱的生物毒性影响了其治疗效果。通过物理结构的“接触诱导”作用改善植介入器械的表面生物学性能,不仅能够改善材料的生物相容性、促进特定组织细胞的增殖,还能够与化学方法相结合进一步改善材料的生物活性,调控干细胞向特定组织细胞分化,实现植介入器械术后的快速组织愈合,恢复相应的生理功能。随着材料加工技术的发展与进步,新型加工技术的应用,特别是多种精密加工技术的复合应用,为实现医学植入器件的高精度结构仿生带来新的契机。未来的植入器械将不仅从宏观结构设计、化学组分上实现与植入部位组织的仿生,还将在表面显微结构上实现与植入部位组织甚至细胞显微结构仿生,实现更精准仿生结构的制备。新型表面仿生技术的发展,必将改善金属植介入产品的治疗效果,提高患者的生存质量。
The authors have declared that no competing interests exist.
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