微生物导致的腐蚀(MIC)在材料腐蚀失效中占重要比例。硫酸盐还原菌(SRB)广泛存在于土壤、海水及河水等自然环境中,是影响管道、油气井等地下金属设施MIC的主要厌氧菌^[1,2]。一般认为SRB的呼吸过程为硫酸盐呼吸,SRB以SO₄^2-为电子受体氧化有机物,利用分子氢、脂肪酸、脂肪烃等有机物作为碳源和电子供体维持其生命所必需的能量^[3],通过分泌胞外聚合物(EPS)形成生物膜黏附于金属表面,加速材料的腐蚀。据报道,含SRB环境中碳钢的点蚀速率高达0.7~7.4 mm/a^[4]。

自1910年Gaines^[5]首次报道MIC现象以来,人们对SRB环境中金属材料的腐蚀行为进行了大量研究^{[6,7,8,9,10,11]},但由于微生物过程的复杂性,对SRB的腐蚀机制仍不明确,目前广泛接受的机理主要有阴极去极化理论^[12]、浓差电池理论^[13]、代谢产物理论^[14,15]、阳极加速理论^[16,17]和近年来提出的直接电子转移理论^{[18,19,20,21,22]}。近几年来,SRB腐蚀研究主要集中于有机酸、H₂S、FeS等代谢产物作用,生物膜作用,以及SRB细胞与Fe间的直接电子作用等。Jia等^[23]提出胞外电子转移方式主导SRB腐蚀过程。作者研究组的结果^[24]表明,在SO₄^2-匮乏环境中,SRB可调整呼吸代谢方式,转而利用Fe(III)、Mn(IV)及H₂等作为末端电子受体^[25],进行胞外呼吸,维持生存代谢,促进碳钢腐蚀的过程。尽管如此,目前人们对影响MIC过程的生物膜及其与膜下金属交互作用等的认识仍然非常有限。

生物膜是细菌在自然环境中的主要生存方式,其对菌群形态、MIC行为等均有至关重要的影响。生物膜构建了微生物于恶劣环境中生存的一种保护模式,研究^[26]表明,生物膜中细菌与浮游细胞的基因表达显著不同;同时,生物膜与腐蚀产物Fe²⁺/Fe³⁺存在络合、螯合作用,与金属间存在直接或间接电子交互作用,但这些交互作用的具体过程和途径尚不清晰。通过这些作用,微生物影响和改变了膜下金属的腐蚀行为和电化学过程。

本工作针对海水中管线钢的MIC过程,采用扫描电镜(SEM)、X 射线光电子能谱(XPS)、扫描振动电极(SVET)、Raman光谱等表面形貌分析技术,结合极化扫描和电化学阻抗谱(EIS)等电化学测量技术,通过生物膜特征及金属-介质-微生物膜间界面一些现象的表征,研究管线钢在存在SRB的热带海水环境中的腐蚀行为,探讨海水环境中SRB生物膜与X80钢间的交互作用,及其对管线钢腐蚀行为的影响。

1 实验方法

1.1 实验材料及介质

实验用X80钢的化学成分(质量分数,%)为: C 0.07,Mn 1.82,Si 0.19,P 0.007,S 0.023,Mo 0.23,Ni 0.17,Cr 0.026,Cu 0.020,V 0.002,Nb 0.056,Ti 0.012,Al 0.028,N 0.004,B 0.0001,Fe余量。电化学测量试样的工作面积为10 mm×10 mm,厚度小于3 mm。试样背面连接Cu导线,用环氧树脂密封非工作面及导线连接处。水磨砂纸逐级打磨工作面至1000号,用去离子水冲洗及酒精清洗,吹干,存于干燥皿中备用。用于SVET测试的样品预先镶嵌在特制环氧树脂中,打磨清洗吹干。

SRB取自渤海海泥,采用修正的Postage's C培养基对SRB进行富集培养。培养基的成分：每升溶液含0.5 g KH₂PO₄,1 g NH₄Cl,0.06 g CaCl_{2 ∙}6H₂O,0.06 g MgSO_{4 ∙}7H₂O,6 mL 70% C₃H₅O₃Na,1 g酵母汁,0.3 g C₆H₅Na₃O₇,0.06 g/L (NH₄)₂Fe(SO₄)₂。由NaOH溶液调pH值至7.0~7.2之间,通N₂除氧及高压灭菌锅灭菌后,密封备用。SRB菌液于4 ℃下保存;实验前在30 ℃下活化12 h。

实验采用通N₂除氧并灭菌处理的3.5%海水晶溶液。将富集培养并经活化后的SRB菌种按5%体积比加入到3.5%海水晶溶液中;灭菌对照组实验将灭菌培养基按5%体积比加入到3.5%海水晶溶液中。实验前实验体系中所用溶液、容器、电极等均经高压灭菌锅或紫外灯照射灭菌处理,避免杂菌污染。

1.2 实验方法

为研究X80钢表面SRB生物膜的形成过程及其对钢基体腐蚀的影响,进行周期为1、3、7和14 d的接菌浸泡实验。实验过程中,定时抽取溶液约1 mL,采用最大可能计数法(MPN)进行细菌计数。所有浸泡实验均在30 ℃恒温水浴锅中进行。

开路电位(E_OCP)及EIS等电化学测试在PARSTAT 2273电化学工作站上进行。测试采用三电极系统：工作电极为X80钢,辅助电极为大面积Pt片,参比电极为饱和甘汞电极(SCE)。线性极化的扫描范围为E_OCP±20 mV,扫描速率为0.166 mV/s。EIS激励信号为10 mV的正弦波,频率范围10^-2~10⁵ Hz,测量结果用ZSimpWin软件进行拟合。

为研究SRB生物膜与钢基体间的电化学交互作用,在生物膜局部划伤处进行SVET微区电化学测试。接菌浸泡14 d后取出试样,用美工刀在试样表面生物膜划一长1 mm的划痕,露出基体金属,在划伤处进行SVET测试。测试采用Model 200型SVET系统,控制软件为ASET 2.0。振动微电极是尖端镀Pt的Pt/Ir合金丝。在SVET测试过程中,探针尖端距离样品表面100 μm,扫描区域为3 mm×3 mm。SVET可以判断出样品表面上方溶液中电流为阳极电流还是阴极电流。

对用于生物膜形貌观察的接菌试样进行微生物固定及脱水处理^[27]：用含3%戊二醛的磷酸缓冲盐溶液固化0.5 h后,依次用PBS溶液和去离子水清洗2次,每次清洗5 min,然后再用50%、75%、95%和99%的酒精进行逐级脱水处理,每次10 min。脱水结束迅速吹干。用于表面元素分析的试样进行酒精清洗、吹干即可。为观察生物膜下试样腐蚀形貌,将试样在500 mL盐酸+500 mL H₂O+3.5 g六次甲基四胺中进行除锈处理。

采用XL30-FEG型SEM观察试样表面腐蚀形貌,由其自带的能谱(EDS)分析腐蚀产物成分。采用SO-TN04显微共聚焦Raman光谱仪分析腐蚀产物。采用ESCALAB 250型XPS确定腐蚀产物中S的化学状态。高清S轨道谱在50 eV下获取,通过标准C谱校准。

2 实验结果和讨论

2.1 SRB生物膜及腐蚀产物形貌

计数结果表明,SRB接菌海水中悬浮细菌数量随时间的变化呈先升高后降低的趋势。模拟海水的pH值在8左右,适宜SRB生长,因此起始阶段SRB细菌数量呈指数上升,第5 d达到最大值,约2×10⁸ cfu/mL。之后由于营养物质的消耗殆尽,细菌数量逐渐下降,到14 d时细菌数量降到了9.5×10⁴ cfu/mL左右。

图1为接菌海水中浸泡3、7和14 d后的X80钢表面SRB生物膜及截面的SEM像。由图可见,浸泡3 d后有些许絮状腐蚀产物分布在试样表面,疏松而不连续(图1a)。由高倍SEM像可发现腐蚀产物同细菌一起黏附在EPS上,构成生物膜(图1b)。白色絮状物多为腐蚀产物,EDS显示此处O含量高。随浸泡时间延长,试样表面腐蚀产物、细菌及EPS逐渐增多,7 d后呈团簇状吸附聚集在试样表面,但生物膜分布尚不连续(图1d和e)。14 d后试样表面可看到包裹着细菌和腐蚀产物的连续生物膜(图1g和h)。有研究^[28]表明,生物膜内细菌密度较悬浮状态高出5~6个数量级。此过程中,生物膜从疏松到连续,其吸附作用源于相邻细菌间的相互协同作用^[29,30]。EPS可通过Van der Waals力、离子键、氢键吸附多种胶体颗粒,达到“架桥”作用,聚集微生物并引起细胞界面更大的吸附^[31]。试样表面生物膜的形成及其结构变化,导致基体表面电化学性质的不均匀性,为局部腐蚀的发生创造条件^[28]。

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图1   接菌海水中浸泡3、7和14 d后X80钢表面的SRB生物膜及截面SEM像

Fig.1   Low (a, d, g) and high (b, e, h) magnified surface SEM images and cross section SEM images (c, f, i) of SRB biofilm of X80 steel after 3 d (a~c), 7 d (d~f) and 14 d (g~i) exposed in inoculated seawater (SRB—sulfate-reducing bacteria, EPS—extracellular polymeric substance)

由截面可见,生物膜厚度随时间的延长而增加(图1c、f和i),膜的结构发生变化,EDS显示S含量也随时间延长而增多。由14 d后截面图可观察到,生物膜中腐蚀产物与EPS等交织在一起,较疏松的白色腐蚀产物膜由表面向膜下延伸,说明生物膜对产物Fe²⁺有吸附作用。这层疏松多孔膜中的FeS使金属表面粗糙度增加,有利于细菌的附着及生物膜的形成^[32]。

2.2 生物膜及腐蚀产物元素分析

接菌海水中试样表面SRB生物膜/腐蚀产物的元素面扫描结果如图2所示。由图可见,X80钢表面SRB生物膜主要由C、O、S、Fe等元素构成,其中,C、O、S等元素明显富集,而Fe含量较基体明显降低。S主要集中于SRB生物膜及其EPS上。实际上,细菌EPS一般包括多糖、蛋白质、核酸、脂质、磷脂和腐殖质等组分,其对生物膜内微生物有保护作用,可避免不利条件的影响。C及O大多集中在腐蚀产物(如Fe的氧化物)上,代谢产物如胞外聚合物上也有少量分布。生物膜与金属存在相互作用,腐蚀产物也会存在于生物膜内,环境中的一些无机沉淀物(如沉积物或垢沉积)也是生物膜的一部分。

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图2   接菌海水中X80钢上生物膜的SEM像及元素面分布图

Fig.2   SEM image and distributions of elements on biofilm of X80 steel in inoculated seawater

图3为X80钢在接菌海水中及灭菌海水(对照组)浸泡14 d后腐蚀产物的Raman光谱。2种环境中在550 cm^-1附近都出现了Raman峰,说明都有Fe₃O₄的产生,Fe₃O₄有较好的致密性和稳定性,是电导体,可参与还原反应。接菌环境中试样在208和282 cm^-1出现Raman峰,且随时间推移强度升高,峰位向右轻微偏移。208 cm^-1对应FeS特征谱线,属点阵模型。282 cm^-1处光谱峰是结构无序峰,属于非晶体硫化亚铁微晶中Fe-S键不对称伸缩振动模型,与文献[33]报道FeS的Raman谱一致。此外,380 cm^-1处Raman峰的出现对应γ-FeOOH的特征峰,说明γ-FeOOH等腐蚀产物的产生。接菌3 d时可检测到FeSO₄峰的存在,而后期该峰消失,说明SO₄^2-浓度减少。

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图3   灭菌及接菌海水中浸泡后X80钢腐蚀产物的Raman光谱

Fig.3   Raman spectra of the corrosion production of X80 steel after 14 d exposed in the sterile and SRB inoculated seawater

图4分别为接菌环境中浸泡1、7和14 d的样品表面S的XPS精细谱。结合能较高的轨道峰对应于S的氧化态,结合能较低的轨道峰对应于S的还原态^[34]。由拟合结果可知,随时间延长,S谱峰值向低结合能方向移动,根据文献[35,36,37,38,39,40,41]确定S的化合价态,对应硫化物示于图中。S元素化合价由+6价向-2价偏移,硫酸盐或亚硫酸盐被SRB还原为低价硫化物。且低价S轨道峰随时间延长而增加,尤其第7 d后更为明显,与菌数量变化相对应,说明接菌条件下SRB的生理活动导致S化合价态降低。精细谱拟合结果中,化合物子峰对应的面积与其含量正相关,通过归一化处理定量分析,各硫化合物占比列于表1。如表1所示,实验初期S主要存在于SO₄^2-中,随着时间的延长而增加,SO₄^2-逐渐转化为S^2-,浸泡7和14 d后S^2-的占比分别为30.48%和37.89%。

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图4   接菌环境中浸泡1、7和14 d后样品表面腐蚀产物中S的XPS精细谱

Fig.4   S spectra of X80 steel after 1 d (a), 7 d (b) and 14 d (c) exposed in the SRB inoculated seawater

浸泡3、7和14 d后SRB生物膜下试样表面的腐蚀形貌示于图5。可见,实验3 d后试样表面腐蚀轻微(图5a),随着浸泡时间的延长,开始出现明显的局部腐蚀(图5b)。有研究表明,低浓度的EPS在碳钢表面吸附成膜抑制阴极反应过程,抑制碳钢的腐蚀^[42];高浓度的EPS对Fe²⁺具有络合作用,能够促进基体材料的阳极溶解^[43]。实验14 d时,出现一些较大的点蚀坑,整个表面出现大量的微小腐蚀坑(图5c)。这说明连续完整的生物膜对均匀腐蚀有减缓作用,但促进了局部腐蚀的发生和发展,这是EPS及生物膜的屏障作用,不均匀分布^[44],及其络合Fe²⁺/Fe³⁺等综合作用的结果。

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图5   接菌海水中浸泡3、7和14 d 后SRB生物膜下X80钢的腐蚀形貌

Fig.5   Corrosion morphologies of X80 steel beneath SRB biofilm after 3 d (a), 7 d (b) and 14 d (c) exposed in inoculated seawater

2.3 SVET测试

X80钢表面SRB生物膜划痕破损处微区SVET电流密度分布如图6所示。SRB生物膜破损处基体为阳极区,阳极电流密度最高达36 μA/cm²;而划痕周围生物膜为阴极区,测试范围内最大阴极电流密度为36 μA/cm²。SVET电流分布说明该MIC腐蚀体系中,生物膜与钢基材间存在局部电化学耦合作用。这种局部耦合作用可能源于生物膜对Fe²⁺/Fe³⁺存在络合/螯合作用^[43],与金属间存在直接或间接电子交互作用,促进基体的局部腐蚀。

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图6   接菌海水中浸泡14 d后X80钢表面SRB生物膜划伤处的SVET电流分布图(电流密度(i)正值为阳极区,负值为阴极区)

Fig.6   SVET images of X80 steel on a scratch of SRB biofilm after 14 d exposed in inoculated seawater (The current density (i) is positive value in the anode region, whereas it is negative in the cathode region)

2.4 开路电位

图7为X80钢在灭菌和接菌海水中的E_OCP随浸泡时间的变化。灭菌海水中E_OCP初始为-720 mV左右,1 d后下降到-735 mV左右,保持2 d后开始上升,恢复到-720 mV左右,这可能由于腐蚀产物积聚所致。接菌海水中,E_OCP从初始的-730 mV降低到-738 mV,保持几天后最终下降至-750 mV左右。可见,2种条件下的E_OCP差异从第5 d开始变大,从第7 d开始E_OCP保持恒定,且差异保持在30 mV左右,此时接菌试样E_OCP的变化与菌数量变化规律呈对应关系,这体现了SRB生物膜的电活性特征^[7,19]。随着浸泡时间的延长,腐蚀产物和代谢产物不断积累,导电性增强,促进钢表面电子转移,导致E_OCP降低。

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图7   灭菌和接菌海水中X80钢开路电位随时间的变化

Fig.7   Open circuit potential (E_OCP) of X80 steel in the sterile and SRB inoculated seawater as a function of time

2.5 电化学阻抗谱及极化电阻

图8为灭菌和接菌海水中X80钢的EIS结果。由Nyquist图可见,由于培养基和腐蚀产物影响,灭菌海水中EIS从第3 d起阻抗弧半径大幅增加(图8a)。随容抗弧增大,Bode图中低频阻抗模值|Z|_{0.01 Hz}增大,最大相位角对应频率减小(图8c),Bode曲线向低频移动,这与逐渐增多的腐蚀产物膜有关。Bode图中|Z|_{0.01 Hz}与Faraday过程相关,其绝对值与腐蚀速率呈负相关。

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图8   灭菌海水和接菌海水中X80钢的Nyquist和Bode图

Fig.8   Nyquist (a, b) and Bode (c, d) plots of X80 steel in the sterile seawater (a, c) and inoculated (b, d) seawater

由接菌海水中的Nyquist及Bode图(图8b和d)可见,前3 d阻抗大于灭菌条件,但3 d后低于灭菌海水中阻抗。第7 d起阻抗降低,反映了SRB对X80钢腐蚀过程的促进作用。接菌的Bode图中相位角峰值对应频率不断向低频移动,移动范围大于灭菌环境,一般认为这种相位角移动是试样表面出现腐蚀的表现^[45]。说明接菌海水中金属与混合膜界面发生变化,SRB在浸泡实验前期对腐蚀起抑制作用,后期却促进腐蚀。

一般而言,EIS中的低频电阻与Faraday反应过程有关,高频电阻与溶液电阻有关。前者反映出钢的腐蚀反应,后者代表了电解质的溶液电阻。故低频阻抗模值可用于表征腐蚀过程的电化学动力学参数。本工作中,极化电阻R_p由下式获得：

Rp=|Z|0.01Hz-|Z|10kHz(1)

式中,|Z|_{0.01 Hz}和|Z|_{10 kHz}分别为0.01 Hz和10 kHz处的阻抗模。由Stern方程^[46]i_corr=B×R_p^-1 (其中,i_corr为腐蚀电流密度,B为常数)可见,R_p与腐蚀速率负相关,R_p^-1可反映腐蚀速率的变化趋势。

图9为实验过程中X80钢的R_p随时间的变化规律。可以看出,实验初期,灭菌海水中X80钢的R_p随时间快速升高,至第3 d达到稳定。接菌海水中,实验前4 d R_p基本稳定,第5 d开始下降。实验前3 d,接菌海水中R_p高于灭菌条件,即腐蚀速率低于灭菌条件;而3 d后,接菌海水中腐蚀速率高于灭菌条件;且浸泡实验后期,接菌海水中的腐蚀速率约为灭菌海水中的10倍(R_p低约1个数量级)。各阶段R_p、SRB数量及E_OCP的变化呈对应关系,说明SRB达一定数量后其代谢产物、胞外聚合物等对试样腐蚀速率起到促进作用。

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图9   灭菌和接菌海水中X80钢极化电阻(R_p)随时间的变化

Fig.9   Polarization resistance (R_p) vs time of X80 steel in the sterile and SRB inoculated seawater

2.6 分析讨论

生物膜是细菌在自然环境中的主要生存方式。微生物群落在水环境中通过浸润表面、细胞生长、复制、吸附、微菌落形成和EPS发展等过程形成生物膜。图10给出了海水中生物膜形成及X80钢的腐蚀过程示意图。实验初期(图10a)细菌主要以浮游态存在于溶液中,数量较少,但其逐渐吸附于钢表面形成微生物菌落并生成EPS,EPS基质对腐蚀离子起一定阻隔作用;同时,EPS有电负性特征,能排斥侵蚀性负离子,抑制X80钢的腐蚀。随着细菌快速增殖,产生大量EPS,形成不均匀的生物膜(图10b)。细菌的直接电子作用^[20]和不均匀分布的生物膜引起浓差电池都可诱发和促进局部腐蚀。同时S^2-与Fe²⁺反应生成FeS附着在基体表面,可与基体形成局部腐蚀电池,诱发点蚀坑的生成^[34]。浸泡后期(图10c),SRB代谢产物与腐蚀产物沉积在钢表面,微生物菌落相互连接成完整生物膜,对均匀腐蚀过程有一定的抑制作用。但生物膜疏松多孔,其包裹的菌及大量的FeS,增加其导电性的同时还促进点蚀的发展,生物膜下酸量的增加也促进腐蚀。SVET结果也显示,生物膜参与阴极过程,从而促进基体腐蚀的发展。

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图10   含SRB海水中管线钢表面生物膜形成及膜下MIC腐蚀过程示意图

Fig.10   Schematics of biofilm formation and corrosion process at the early stage (a), middle stage (b) and final stage (c) of X80 steel in SRB inoculated seawater

3 结论

(1) X80钢在含SRB海水浸泡过程中,SRB细胞附着期及生物膜形成初期,EPS的屏障作用抑制X80钢的腐蚀过程;但后期SRB的呼吸代谢活动导致X80钢的自然腐蚀电位降低约20 mV,并显著促进了管线钢的局部腐蚀过程。

(2) 由EIS测试结果推测,含SRB海水中浸泡后期X80钢的腐蚀速率较灭菌对照组高约1个数量级。SRB及其生物膜的作用致使X80管线钢发生严重点蚀。

(3) 海水中SRB代谢过程促进S从SO₄^2-向S^2-转变,并以FeS的形式在生物膜中沉积。生物膜作为阴极覆盖在试样表面,其与腐蚀产物间的络合、螯合作用,细胞及其代谢产物、生物膜与金属间存在直接或间接电子交互作用,这些作用相互协同耦合,促使生物膜下局部腐蚀的发生和发展。

The authors have declared that no competing interests exist.