1 前言

海洋环境中的材料腐蚀问题普遍存在，不仅缩短了海洋工程结构的使用寿命，大大增加了维护维修费用，而且还直接影响了工程设施或设备的使用安全，造成巨大的隐患^[1,2]。硫酸盐还原菌 (SRB) 是海洋环境中最重要的腐蚀微生物，可引起严重的腐蚀危害。它们通常可粘附在固体金属或其他材料表面，进而形成复杂的生物膜，造成微生物腐蚀。生物膜的形成包括微生物粘附、微种群形成以及成熟生物膜菌落形成3个阶段^[3]。研究表明，微生物在材料表面的初始附着是生物膜形成和发展过程中的一个关键阶段^[4]。

在微生物附着的初始阶段，细胞和基体的表面性质，如荷电性和润湿性等^[5,6]，以及环境因素，如温度和pH值，均对微生物的附着有重要的影响。仅就基体的表面性质而言，荷电性和润湿性在细菌初始附着阶段起主要作用^[7]，关于材料表面润湿性的影响已有较多报道^[8]，但对于荷电性影响的研究还略显缺乏。

自组装技术是一种有效改变材料表面性质，如荷电性和润湿性的方法，具有简便易得、取向有序、稳定可靠、性质多样、可以预期结构的优势，近年来生物粘附研究方面的应用日益广泛^[9]。另外，许多实时监测手段也广泛应用于微生物粘附研究领域，主要包括表面等离子体共振^[10]、原子力显微镜^[11]、石英晶体微天平^[12]、表面声波^[13]、共聚焦显微镜^[14]、光电流检测^[15]、循环伏安^[16]以及电化学阻抗谱 (EIS)^[17]等。其中，EIS由于具有灵敏度高、体积小、费用低、检测快、操作简单和可实现原位测定的优势，已较多地应用于细菌在材料表面附着的研究中^[18]。

本研究构建了3种荷电状态的自组装膜 (SAMs) 表面，用EIS和扫描电子显微镜 (SEM) 的方法监测SRB在材料表面的附着。研究的结果有利于更好地理解细菌初始附着的机制，对于控制微生物腐蚀具有一定的科学意义。

2 实验方法

培养基组成：K₂HPO₄3H₂O 0.65 g，NH₄Cl 1.00 g，Na₂SO₄ 0.50 g，CaCl₂ 0.10 g，MgSO₄ 2.00 g，乳酸钠4.00 mL，酵母浸出粉1.00 g，陈海水1 L。将配置好的培养基用盐酸或氢氧化钠调节pH值为7.2±0.2，并分装在250 mL磨口玻璃瓶中，通入N₂ 30 min，用报纸封口，蒸汽压力锅 121 ℃灭菌30 min。同时将玻璃瓶塞、移液枪的枪头一起置于蒸汽压力锅中灭菌。待培养基冷却后，在超净工作台中进行接种。取生长良好的SRB菌液5 mL接于250 mL已灭菌的培养基中，加塞密封，用锡纸包好，置于培养箱中于30 ℃条件下培养4 d。所有培养基、容器及磨口塞等均在紫外灯下灭菌后使用。将已培养4 d的SRB菌液离心，去掉上清液，用0.2 mol/L PBS (pH 7.4) 溶液使细菌重悬浮，重复离心3次，每次离心速度5000 r/min，时间为10 min。得到的细菌悬液在600 nm波长条件下测定吸光度，用PBS溶液调节细菌浓度，使其吸光度约为1。使用Zetasizer Nano-ZS90电位仪测定所得细菌悬液的Zeta电位。得到的细菌悬液未使用时置于4 ℃冰箱中保存。

由于金表面的硫醇分子自组装膜最稳定、性能最可靠，同时，Au作为惰性金属，在电解质溶液中不易发生腐蚀，因而不会干扰电化学交流阻抗的测定，因此本研究中选择Au为基体，构建硫醇自组装膜。将待修饰的金电极分别用1.0和 0.05 µm的Al₂O₃粉末在抛光布上抛光成镜面，依次用无水乙醇、二次水超声清洗，每次5 min。在0.5 mol/L硫酸溶液中，以Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，扫描速度为1 V/s，扫描范围为-0.2~1.6 V，循环伏安扫描直到稳定，每次扫描一百个循环，电化学工作站型号为CHI 604D。分别将处理好的电极浸入浓度为5 mmol/L的6-胺基-1-己烷硫醇，6-巯基-1-己醇，和6-巯基己酸的乙醇溶液中，分别于浸泡12 h后取出。依次用无水乙醇和超纯水冲洗，用N₂吹干后用JC 2000C接触角测量仪测定3种SAMs表面的水接触角。

将处理好的3种SAMs修饰电极浸于已准备好的SRB悬液中，分别于0，10，20，30，40，50，60，80，120，150，180，240和300 min后取出，用超纯水轻轻冲洗，在5 mmol/L [Fe(CN)₆]^3-/4-的PBS溶液中测定电化学阻抗，电化学工作站型号为CHI 604D。频率范围为10⁵~10^-1 Hz，正弦波交流信号幅值为5 mV，使用开路电位作为初始电位。

按戊二醛，PBS和无菌水体积比为1∶5∶4的比例配置固定液，分别将在SRB悬液中浸泡0，10，30，60，120和180 min的3种自组装膜修饰电极用灭菌的PBS冲洗后，浸于固定液中固化1 h。取出样品后分别用体积浓度为50%，70%和90%的乙醇溶液各脱水15 min，最后在无水乙醇中脱水15 min，并连续进行两次。脱水完成后将样品进行超临界干燥，然后采用KYKY-2800B SEM进行观察。

3 结果与讨论

3.1 不同荷电状态表面的构建与表征

3种用于构建SAMs的硫醇分子的化学结构以及在金表面形成SAMs后的结构如图1所示，将在金表面形成的6-胺基-1-己烷硫醇自组装膜、6-巯基-1-己醇自组装膜和6-巯基己酸自组装膜分别表示为AH-Au、MH-Au和MHA-Au。由于3种硫醇分子的pKa值各不相同，故形成的3种SAMs置于pH值为7.4的PBS中时表面带电情况不同。分别表现为：以胺基为末端的SAMs表面荷正电，以羟基为末端的SAMs表面呈电中性，以羧基为末端的SAMs表面荷负电。AH-Au，MH-Au和MHA-Au接触角分别为32.5°±0.5°，28.4°±1.4°和30.6°±0.5°，接触角的数据显示3种SAMs表面的润湿性相似，因此可排除由于表面润湿性差异而造成细菌吸附情况不同的可能性。

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图1   用于构建SAMs的3种硫醇分子的化学结构和Au表面形成的3种SAMs的结构示意图

Fig.1   Chemical structures of the thiol molecules used for the preparation of SAMs and scheme of SAMs modified on Au surface: (a1) 6-Amino-1-hexanethiol, (a2) 6-Mercapto-1-hexanol, (a3) 6-Mercaptohexanoic acid, (b1) AH-Au, (b2) MH-Au, (b3) MHA-Au

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图2   3种SAMs表面在含有5 mmol/L [Fe(CN)₆]^3-/4-的PBS中的电化学阻抗谱

Fig.2   Nyquist diagrams for the Faradaic impedance measurement of three kinds of SAMs in 0.2 mol/L PBS solution (pH 7.4) containing 5 mmol/L [Fe(CN)₆]^3-/[Fe(CN)₆]^4-(1∶1): (a) AH-Au and MH-Au, (b) MHA-Au

EIS已被证实可用于表面层层组装过程的表征^[19]。对于3种SAMs表面的电化学阻抗谱如图2所示。在含有[Fe(CN)₆]^3-/4-氧化还原探针的体系中，电化学阻抗由图3所示的等效电路进行拟合。其中，R_s和Z_w不受发生在电极表面的化学转化的影响，而R_ct和C_dl的值则有赖于电极/电解质界面的介电绝缘性质^[20]。沉积在电极表面的不溶物质会阻碍界面电荷转移，从而使R_ct数值增加^[21]。拟合之后得到的R_ct数值分别为0.08972，1.30333和58.09799 kΩcm²。

3.2 SRB附着的电化学测试

EIS同样可用于监测SRB在材料表面的附着情况。由于细胞本身的绝缘性，当其附着在电极表面时，也可使表面R_ct数值增大^[22]。SRB在3种SAMs表面附着不同时间的电化学阻抗谱如图4a~c所示，将这些电化学阻抗数据经图3所示的等效电路进行拟合，得到R_ct-时间曲线 (图4d和e)。对于以胺基和羟基为末端的SAMs表面来说，随附着时间的增长，SRB附着量逐渐增加，使R_ct值逐渐增大至稳定。而以羧基为末端的SAMs表面的R_ct值则随附着时间延长呈现出持续减小的变化，而且R_ct值达到平衡的时间较其他两种情况更长。这样的结果是因为随SRB在表面的附着量逐渐增大，虽然细胞作为绝缘粒子对[Fe(CN)₆]^3-/4-电子传递的阻碍作用有所增强，但同时也覆盖了原来对[Fe(CN)₆]^3-/4-起静电排斥作用的位点，使得静电排斥作用极大减弱。在两种作用的共同影响下，R_ct值呈现出随时间逐渐减小至稳定的变化趋势。以上所述内容示意图如图5。

另外，经测定，SRB细胞表面带有3 mV左右的负电荷。因此，在初始附着阶段，SRB在荷正电的胺基SAMs表面的吸附量应大于在荷负电的羧基SAMs表面的吸附量。而细胞与表面的静电排斥作用不利于附着的进行，表现为R_ct值达到平衡的时间延长。当部分SRB附着在电极表面后，由于本身代谢产物等因素的影响，其附着可能会进一步加强，进入不可逆附着阶段。此时，表面润湿性和荷电性对于细菌附着的影响作用越来越不明显，直至可以忽略。

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图3   3种SAMs表面的电化学阻抗等效电路

Fig.3   General equivalent circuit for an electrochemical cell in the presence of a redox probe: R_s-the ohmic resistance of the electrolyte solution, Z_w- the Warburg impedance, R_ct-charge-transfer resistance of the redox probe, C_dl-the double-layer capacitance

3.3 SRB附着的SEM分析

SRB在3种表面附着不同时间的SEM图像如图6所示。对SEM图像上的SRB数量进行统计，结果见图7a。由图中数据可以看出，在3种SAMs的表面，SRB的附着密度随时间逐渐增大。其中在以胺基和羟基为末端的SAMs表面，SRB的附着在3 h内可达到稳定，但在以羧基为末端的SAMs表面，附着3 h时，SRB的附着密度仍存在增大的趋势，说明其达到平衡的时间较其他3种表面更长。就3种SAMs表面来说，以胺基为末端SAMs表面的SRB附着密度最高，以羟基为末端的SAMs表面次之，以羧基为末端的SAMs表面最低。

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图4   SRB在3种SAMs表面附着不同时间的电化学阻抗谱和R_ct-时间曲线

Fig.4   Nyquist diagrams for the Faradaic impedance measurement of SRB adhesion on three kinds of SAMs in 0.2 mol/L PBS solution (pH 7.4) containing 5 mmol/L [Fe(CN)₆]³/[Fe(CN)₆]^4- (1∶1): (a) AH-Au, (b) MH-Au, (c) MHA-Au and the relationship between R_ct on three kinds of SAMs with SRB adhesion and adhesion time (d, e)

3.4 SRB的粘附动力学特征

将R_ct值变化率和SRB附着密度随时间的变化进行比较 (图7)，两者均能反映出在初始附着阶段SRB在表面的附着量逐渐增大至稳定的过程，同时也体现了不同荷电状态表面之间SRB附着量和附着平衡时间的差距。在此阶段，SRB附着量越大、附着平衡时间越短，意味着表面与SRB之间的亲和性越好。EIS和SEM结果均表明，在3种SAMs中，以胺基为末端的SAMs最有利于SRB的初期附着，而以羧基为末端的SAMs最不利于SRB的初期附着。另一方面，由于两种方法所反映出的SRB附着规律相一致，因此用R_ct值变化率可在一定程度上反映SRB的初期附着情况，证实了EIS是一种有效实现SRB附着动态监测的方法。

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图5   有SRB附着时自组装膜表面的电子传递过程示意图

Fig.5   Principle of the electron transfer process influenced by SAMs and SRB: (a) AH-Au, (b) MH-Au, and (c) MHA-Au

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图6   SRB在3种SAMs表面附着不同时间的SEM像

Fig.6   SEM images of SRB adhesion on AH-Au (a1~a3), MH-Au (b1~b3) and MHA-Au (c1~c3) at 10 min (a1, b1, c1),1 h (a2, b2, c2) and 3 h (a3, b3, c3)

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图7   3种自组装膜表面的SRB附着密度-时间曲线和Rct值变化率-时间曲线

Fig.7   SRB adhesion density (a) and Rct change rate (b) of three kinds of SAMs with adhesion time

4 结论

(1) SRB在材料表面的初始附着是微生物腐蚀过程中的一个关键阶段，材料表面荷电性在这一阶段起重要的影响作用。

(2) 利用自组装技术可制备具有不同荷电状态的材料表面，利用EIS和SEM技术可动态监测SRB在表面的附着情况。结果表明，材料表面荷电性对SRB的初期附着量和附着平衡时间影响显著，3种自组装膜表面的R_ct值变化率可在一定程度上反映SRB在表面的附着情况。

(3) 本研究所采用的SAMs和EIS技术，对于研究材料表面性质对微生物附着过程的影响机制具有重要的意义，进而有利于进行微生物腐蚀及防护方面的研究。