金属学报(中文版)  2018 , 54 (6): 943-949 https://doi.org/10.11900/0412.1961.2017.00285

Orginal Article

Ti6Al4V表面生物功能纯Mg薄膜制备及性能研究

于晓明1, 谭丽丽1, 刘宗元1, 杨柯1, 朱忠林2, 李扬德3

1 中国科学院金属研究所 沈阳 110016
2 江苏奥康尼医疗科技发展有限公司 苏州 215123
3 东莞宜安科技股份有限公司 东莞 523808

Preparation and Properties of Biological Functional Magnesium Coating on Ti6Al4V Substrate

YU Xiaoming1, TAN Lili1, LIU Zongyuan1, YANG Ke1, ZHU Zhonglin2, LI Yangde3

1 Institute of Metal Research, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016, China
2 Jiangsu OKANI Medical Technology Co., Ltd., Suzhou 215123, China
3 Dong Guan EONTC Co., Ltd., Dongguan 523808, China

中图分类号:  TB741

文章编号:  0412-1961(2018)06-0943-07

通讯作者:  通讯作者: 谭丽丽,lltan@imr.ac.cn,主要从事生物材料与器件的研究

收稿日期: 2017-07-10

网络出版日期:  2018-06-10

版权声明:  2018 《金属学报》编辑部 《金属学报》编辑部

基金资助:  国家自然科学基金项目Nos.51631009、81500897和81400528,以及国家重点研发计划项目No.2016YFC1101804

作者简介:

作者简介 于晓明,男,1981年生,博士

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摘要

利用多弧离子镀技术在Ti6Al4V表面沉积纯Mg薄膜,研究了工作气压对纯Mg薄膜表面质量及性能的影响,研究了纯Mg薄膜的体外降解等性能、抗菌性及生物安全性能。结果表明:多弧离子镀方法可将纯Mg薄膜制备于钛合金表面,薄膜颗粒均匀致密,未见明显缺陷。体外浸泡实验结果表明:由于Ti6Al4V与Mg发生电偶腐蚀而使Mg薄膜迅速降解,1周时间内薄膜基本降解完毕。抗菌实验结果表明:纯Mg薄膜样品对金黄色葡萄球菌具有强烈的杀灭作用,表现出良好的抗细菌感染功能。细胞毒性实验结果表明:纯Mg薄膜可促进骨髓间充质干细胞(rBMSCs)的增殖。

关键词: 钛合金 ; 纯Mg薄膜 ; 生物性能

Abstract

Currently, metallic biomaterials used in orthopedics are normally bioinert which is hard to integrate with the bone tissue inducing aseptic loosening and easy to get infection, which is the main reason of implantation failure. Mg base metals are considered to be a new generation of revolutionary metallic biomaterials due to its similar density and mechanical properties with natural bone, good biocompatibility, degradability in the body as well as the biological functional ability to promote new bone tissue formation. In addition, the degradation of Mg may increase the local pH which can inhibit the growth of bacteria. In this work, pure Mg coating was deposited on Ti6Al4V substrate by arc ion plating. The effects of different working pressures on the surface quality and properties of Mg coating were investigated. The degradation, antibacterial and biosafety properties were studyied. The results showed that the pure Mg coating can be deposited on the surface of Ti6Al4V substrate and the coating was uniform and smooth. The immersion test in vitro showed that the degradation was very fast because of galvanic corrosion, and the whole process was finished in about one week. The results of antimicrobial experiments showed that the Mg coating can kill staphylococcus aureus and showed good antibacterial function. The results of cytotoxicity test showed that Mg coating promoted rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (rBMSCs) growth and proliferation.

Keywords: Ti alloy ; pure Mg coating ; bioproperty

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于晓明, 谭丽丽, 刘宗元, 杨柯, 朱忠林, 李扬德. Ti6Al4V表面生物功能纯Mg薄膜制备及性能研究[J]. 金属学报(中文版), 2018, 54(6): 943-949 https://doi.org/10.11900/0412.1961.2017.00285

YU Xiaoming, TAN Lili, LIU Zongyuan, YANG Ke, ZHU Zhonglin, LI Yangde. Preparation and Properties of Biological Functional Magnesium Coating on Ti6Al4V Substrate[J]. Acta Metallurgica Sinica, 2018, 54(6): 943-949 https://doi.org/10.11900/0412.1961.2017.00285

随着人口老龄化及运动伤害的增多,人们对骨科植入材料的需求与日俱增。骨科植入材料是一类可以置换患有疾病或损伤的骨骼,促进骨组织愈合,修正畸形骨骼功能的生物材料。目前,全球生物材料中骨科植入材料应用产品的需求最大,在全球生物材料市场占有率高达37.5%。骨科内植入产品,主要包括脊柱类产品、创伤类产品、人工关节产品、神经外科产品等[1]。骨科植入材料种类丰富,其中在临床上使用的骨科植入材料就达几十种。它们通常可以根据材料类型划分为金属材料、陶瓷材料、高分子材料、复合材料以及天然材料。理想的骨科材料需要具备生物相容性,无毒性,合适的力学性能、重量和密度,易加工,灭菌方便等。而金属材料由于其优异的综合力学性能且满足上述所有要求而广泛应用于骨科领域。

钛合金是一种临床广泛应用的金属骨科植入材料,其相对于不锈钢和CoCr合金具有更好的生物相容性,更低的密度,更优异的力学性能和更佳的耐腐蚀性能,这些特点使得钛合金作为植入器件具有最显著的优势[2,3]。然而,钛合金属于生物惰性材料,与人骨整合能力不佳而引起无菌性松动,进而导致植入失效。同时,作为常见的术后并发症,植入后的细菌感染已经成为21世纪医学领域内亟待解决的重要问题之一。据统计,美国骨科植入物相关感染的年发病率达到4.3%左右。根据世界卫生组织(WHO)颁布的《院内感染防治实用手册》中的有关数据,每天全世界有超过1400万人在遭受院内感染的痛苦,其中60%的细菌感染与使用植入物有关。细菌感染一旦发生,通常患者还需再经历1~2次的手术取出植入物并清除病灶,给患者带来沉重的经济与精神负担,同时也会对医院和社会等造成不同程度的负面影响。因此,研究开发骨结合性良好、自身具有抗细菌感染功能的新型医用材料,以提高植入材料长期稳定性和有效性、减少或消除相关医疗器械引发的细菌感染性疾病具有重大的社会经济意义。

近年来,由于在生物环境下可发生腐蚀降解,镁基金属在医用金属材料领域中成为新的研究热点[4,5,6,7],镁基金属相对于可降解高分子材料具有更优异的力学性能、更佳的生物相容性及更低廉的成本,更值得关注的是降解过程中不仅释放出Mg2+,同时还会生成OH-,形成局部碱性环境[8,9]抑制细菌的生长。金属Mg降解过程中释放的Mg2+、形成的碱性环境甚至H2释放等综合因素均有利于对抗菌[8,9,10]、抗肿瘤[11,12,13]、促成骨[14,15,16,17]和其它多重生物功能性[18,19,20]。因此本研究采用薄膜制备技术将纯Mg制备于钛合金材料表面,将金属Mg的生物功能性赋予到钛合金植入器件,即利用了钛合金的力学性能的优势,又发挥了Mg的生物功能性,使其成为理想的骨科植入材料。

1 实验方法

采用Bulat 6多弧离子镀系统[21,22]制备纯Mg薄膜,设备示意图如图1所示。衬底选择Ti6Al4V钛合金,由江苏奥康尼医疗科技发展有限公司提供,将轧制态钛合金切割为10 mm×10 mm×3 mm规格的方片,用SiC砂纸打磨到2000号,用无水乙醇超声洗20 min,干燥N2吹干备用。将纯度为99.99%的纯Mg加工为指定规格的靶材,放置在设备靶材固定位置,衬底样品放置在离阴极纯Mg靶材40 cm处的样品台上。在沉积前,将沉积室的背底真空抽至6×10-3 Pa,通入Ar气进行离子轰击以去除衬底表面的氧化物及吸附的杂质。轰击时工作气压0.3 Pa,轰击靶弧电流50 A,轰击3 min。沉积过程中,在阴极弧上面叠加一个脉冲电压,偏压为-100V,脉冲频率为30 kHz,占空比为40%,电流密度范围为0.15~0.20 A/cm2,以下参数保持恒定:弧源电流为50 A,弧压为14.5 V,为保证均匀,样品台可沿竖直方向旋转,衬底温度设定为235 ℃。上述实验参数不变的条件下,分别在不同工作气压条件下(10-3、10-2、10-1和100 Pa)进行实验样品的制备。

图1   多弧离子镀系统示意图

Fig.1   Schematic of the arc ion plating system

采用S-3400N扫描电子显微镜(SEM)观察纯Mg薄膜形貌和薄膜厚度,用设备自带的能谱仪(EDS)表征薄膜元素组成以及沿截面元素分布情况。采用D/max 2500 X射线衍射仪(XRD)表征薄膜的相成分,其中衍射角范围为15°~85°,扫描步长为0.04°,扫描速率为4°/min。按照标准ISO10993-15,将实验样品浸泡于(37±0.5) ℃的Hank's 模拟体液(pH=7.4)中进行薄膜降解性能研究,样品表面积与Hank's溶液的浸泡比例为1.25 cm2/mL,每24 h使用Lei-ci PHS-3C pH 计测定溶液pH值,并进行换液。将样品浸泡于不含Mg、Ca元素的Hank's溶液中,其成分为:NaCl 8g/L,KCl 0.4 g/L,KH2PO4 0.06 g/L,NaH2PO47H2O 0.09 g/L,NaHCO3 0.35 g/L,Glucose 1 g/L。浸泡比例为1.25 cm2/mL,每隔24 h定时换液,换液前,分别取浸泡1、3、5 d的上清液,采用Z-2000等离子体发射光谱仪(ICP-AES)测量相应的离子含量,测量时Mg元素对应波长为285.2 nm。抗菌性实验中将Mg涂层样品及Ti6Al4V样品正反面紫外照射灭菌后放于24孔板中,按照GBT16886.5-2003标准以样品表面积与细菌悬液1.25 cm2/mL比例浸泡于事先配制好的浓度为(1.0~2.0)×105 cfu/mL的细菌悬液中,并放于37 ℃的恒温培养箱中分别培养6、12和24 h;到达时间点后,将各孔中细菌悬液稀释至(1.0~2.0)×103 cfu/mL;吸取0.1 mL的稀释后细菌悬液加入到固体培养基平板中,使用灭菌三角耙将菌液均匀地涂满整个培养基平板,在5%CO2、37 ℃恒温细菌培养箱中培养24 h;取出固体培养基平板,菌落计数,计算材料的杀菌率,从而评估材料的杀菌能力。杀菌率计算公式为:材料杀菌率(%)=[(对照组钛合金菌落数-实验材料活菌数)/钛合金活菌数]×100% (杀菌率≥90%,被认为具有杀菌作用)。实验材料平行样3个,实验重复3次。细胞毒性实验根据ISO 10993-5采用四唑盐(MTT)比色法进行,细胞选择兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)。各实验均使用平行样3个,实验重复3次。

图2   不同工作气压条件下钛合金表面纯Mg薄膜样品的XRD谱

Fig.2   XRD patterns of Mg coatings on Ti alloy gained at different pressures

2 实验结果

2.1 薄膜表面相结构与形貌

图2为钛合金表面纯Mg薄膜样品的XRD谱。图中可见钛合金衬底的特征峰,在4种工作气压下,均可见纯Mg的衍射峰,这表明采用多弧离子镀方法可在钛合金衬底上沉积纯Mg薄膜。10-3 Pa下,Mg的衍射峰更为明锐,说明该条件下Mg薄膜的结晶性能最佳。通过标准PDF卡片对比发现,所有样品中均未发现应在36.6°出现的最强峰(101)峰,而应出现在34.4°的次强峰(002)峰成为最强峰,同时在72.5°的(004)峰也明显增强,说明钛合金表面多弧离子镀法制备的纯Mg薄膜呈现[00l]择优取向生长。

图3a~d为不同工作气压下钛合金表面纯Mg薄膜的SEM表面形貌。可见,衬底均被Mg颗粒完全覆盖,颗粒均匀排列,颗粒尺寸为1~3 μm。样品表面除存在白色大颗粒之外,并无明显缺陷,这些白色大颗粒是多弧离子镀法制备薄膜很难避免的缺点。所有样品均呈现整体光滑平整、微小缝隙均匀分布的特征。10-2和10-1 Pa条件下的薄膜表面具有相近的形貌,颗粒相对10-3和100 Pa条件下样品更大。10-3和100 Pa样品Mg颗粒更为致密,缝隙较小。经过EDS分析可见Mg、Al、Ti和V元素,100 Pa样品的Mg含量更高,约为55% (原子分数,下同),其它样品约为45%。为测试薄膜的厚度,将薄膜样品横截面进行SEM观察,随着工作气压增大,薄膜厚度增加,100 Pa样品薄膜厚度约为10 μm (图3e)。

图3   不同工作气压下钛合金表面纯Mg薄膜的SEM像

Fig.3   Surface (a~d) and cross section (e) SEM images of Mg coatings on Ti alloy at pressures of 10-3 Pa (a), 10-2 Pa (b), 10-1 Pa (c) and 100 Pa (d, e)

2.2 薄膜降解

Mg降解产生的碱性环境使pH值升高,因此可通过测量浸提液pH值变化反映Mg降解情况。图4为不同工作气压条件下,纯Mg薄膜的pH值-时间曲线。可见,各薄膜样品浸泡1 d后,溶液pH值均迅速从7.4达到10.0左右,但仍低于对照组纯Mg块体样品的pH值,随后pH值呈下降趋势,浸泡2 d溶液的pH值下降为8.5~9.0,1~5 d范围内pH值呈迅速下降趋势,5~7 d范围内pH值下降速率降低,7 d时的pH值已经与钛合金基本一致。纯Mg在浸泡过程中,呈现略微下降的趋势。在不同气压沉积的4种薄膜样品pH值变化曲线中,100 Pa的pH值最低,其次是10-3 Pa,pH最高者为10-1 Pa。结合薄膜的表面形貌,100和10-3 Pa表面更为致密,因此在初期耐腐蚀性更佳,而表面形貌相似且较为疏松的10-1和10-2 Pa则表现出更高的pH值。经过曲线斜率的计算,发现100 Pa的pH值下降速率更小,而10-3 Pa的pH值下降速率最大,因此100 Pa的耐腐蚀性最佳。

图4   不同工作气压条件下纯Mg薄膜的pH值曲线

Fig.4   pH curves of Hank's solution immersed with Mg coatings gained at different pressures

2.3 离子溶出

从Mg的生物功能性角度出发,选取表面Mg薄膜更耐降解的100 Pa样品进行离子溶出实验,结果如图5所示。从图5中可以看出,薄膜中Mg2+在第1 d的溶出量约为52×10-6,第3 d时Mg2+释放量急剧下降到10×10-6,第5和7 d释放量趋于稳定,释放量约为6×10-6。经过7 d的浸泡,Mg2+释放量逐渐积累达到73×10-6,表明Mg薄膜是不断降解的。与图4浸泡pH曲线所示结果一致,前3 d薄膜降解最快,但降解速率是逐渐放缓的,因此Mg2+的释放也是经历迅速到放缓的过程。

图5   100 Pa下纯Mg薄膜样品的离子溶出结果

Fig.5   Ion release of magnesium coating gained at 100 Pa (single day release)

2.4 抗菌性能

选取100 Pa工作气压条件下的钛合金纯Mg薄膜样品作为实验组,研究纯Mg薄膜能否抑制细菌生长,为钛合金植入件的植入提供一个良好的生理环境[23]。本实验选择骨科手术中最常见的致病菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)作为研究对象。

图6S.aureus在37 ℃条件下分别与钛合金表面纯Mg薄膜和钛合金共培养6、12和24 h后材料的杀菌能力效果图,可以更加直观地观察随着材料与细菌共培养时间延长,细菌数量的变化规律。由图可知,细菌与材料共培养6 h后,钛合金对照组的固体培养基中可观察到大量S.aureus,钛合金纯Mg薄膜样品共培养后涂板的固体培养基上S.aureus数量均明显少于钛合金对照组;随着共培养时间的延长,钛合金纯Mg薄膜的固体培养基中细菌数量急剧下降,当培养时间延长至24 h时,实验组中固体培养基上未发现S.aureus,说明此时细菌被完全杀死,说明纯Mg薄膜具有杀菌功能,而对照的钛合金的固体培养基中细菌数量未见减少,说明钛合金不具备杀菌能力。

图6   金黄色葡萄球菌(S.aureus)在37 ℃条件下分别与钛合金纯Mg薄膜样品以及钛合金共培养后材料的杀菌能力效果图

Fig.6   Antibacterial effects of Ti alloy (a~c) and coated with Mg (d~f) co-cultured with S.aureus at 37 ℃ for 6 h (a, d), 12 h (b, e) and 24 h (c, f)

经计算分析随着细菌与材料共培养时间延长,钛合金纯Mg薄膜样品的杀菌率均不断升高。当细菌与材料共培养6 h时,钛合金纯Mg薄膜样品组的杀菌率就达到86%,说明共培养6 h时,钛合金纯Mg薄膜样品对S.aureus的杀灭作用较强;当时间延长至12 h时,杀菌率上升达到95%;24 h后,钛合金纯Mg薄膜样品组对S.aureus的杀灭作用均达到99.99%,说明此时可完全杀死细菌,表现出良好的杀菌效果。实验结果表明,钛合金表面纯Mg薄膜样品对S.aureus发挥杀灭作用需要一段时间,随着材料与细菌共培养时间延长,材料杀菌作用增强,且当共培养时间达到24 h时,可完全杀灭细菌,说明钛合金纯Mg薄膜样品表现出良好的抗菌作用。

2.5 细胞毒性

图7是rBMSCs细胞在Mg薄膜样品和钛合金不同稀释浓度的浸提液中培养1、2和3 d的细胞增值率。Mg薄膜在培养1 d后的细胞毒性都在1级以上,细胞毒性合格,满足生物医用材料的要求。细胞在不同稀释浓度的薄膜浸提液培养下,表现出不同的增殖率。稀释程度越大,细胞的增殖率越大。各个稀释浓度下,细胞的增殖率均随培养时间的增加而增加。但未经稀释的浸提液的细胞增殖率较低,且随时间的增加变化不明显。未稀释的Mg薄膜浸提液之所以呈现较低的增殖率,是因为薄膜降解引起较高的pH值,不利于细胞的生长,随着浸提液被稀释,pH值降低,细胞增殖率增加。随着培养时间的增加, 细胞增殖率增加是由于pH值在细胞培养过程中被稀释,同时Mg2+的释放对细胞产生作用。Mg的降解速率在体外和体内相差约4个数量级[24],根据体内不同的位置,降解速率不同程度的降低,同时由于体液的交换,局部碱性的升高对细胞不仅会产生不利影响,而且可能正是该原因而对细胞增殖产生促进作用。

图7   rBMSCs细胞在不同稀释浓度的浸提液中培养1、2和3 d的细胞增殖率

Fig.7   Cell viabilitiy of titanium alloy coated with Mg and titanium alloy incubated with rBMSCs cells after 1, 2 and 3 d under different dilution ratios

3 分析讨论

Salunke等[25]采用蒸镀法在Si片表面制备了纯Mg薄膜,相对真空蒸镀制备的薄膜,多弧离子镀法制得的Mg颗粒尺寸小1个数量级,且更为致密。多弧离子镀法通过引弧使弧斑在Mg靶材表面运动而产生Mg等离子体,这些等离子体在外加的脉冲电压作用下与基体发生剧烈的碰撞,离子达到基体表面时本身所具有的能量要高于直接蒸发出来的Mg原子,同时Mg气源为等离子体,相对蒸发法的Mg原子团更小,到达基体的原料单元更小,形核中心数量高于蒸镀法,因此多弧离子镀方法制备的薄膜颗粒更小,更加致密。对于薄膜生长,通常情况下晶体沿短轴方向生长速率快,垂直于长轴方向的晶面密度较大,从能量的角度说,这样的格位更加稳定。纯Mg为hcp结构,其晶格常数a=0.3208 nm,c=0.5209 nm,沿a轴方向生长速率较快,因此在图3中可见薄膜呈现片层状且逐层堆垛生长的特征。图2的XRD谱中(002)和(004)峰明显增强,这也说明薄膜存在更多的晶面沿垂直于c轴方向生长,蒸镀法制备的薄膜未呈现[00l]择优生长情况。这种择优生长是否对薄膜性能(如降解性)产生影响有待进一步研究。图4中Mg涂层及纯Mg降解pH值情况显示,纯Mg块体在降解初期(1 d)的pH值高于Mg薄膜样品,pH值越高表明降解程度越大,这意味着纯Mg涂层的耐蚀性优于纯Mg块体,这主要是由于薄膜制备方法对材料有一定的纯化作用,使得薄膜中杂质更少。杂质通常为Fe、Cu、Al和Ni等合金元素,这些元素的腐蚀电位均高于Mg,因此会发生电偶腐蚀而加速了Mg基体的降解。多弧离子镀技术中,各个元素的离化率不同,成膜所需的各项参数也有很大差异,不同的参数将使特定的元素离化并沉积在基材上,从而减少了杂质元素,降低了由于杂质而引起的腐蚀[25,26]。由于薄膜相对块体总量较少,随着降解进行,薄膜逐渐消耗,最终降解完毕,因此pH值迅速下降,而块体pH值的下降是由于降解产物沉积在材料表面起到了一定的保护作用,同时块体总量较大,至测试时间,材料仍未降解完全,因此pH值下降缓慢薄膜。对于薄膜样品,不同的工作气压对薄膜表面形貌的影响较大,进而影响了薄膜的降解过程。10-1和10-2 Pa样品,薄膜表面颗粒与Hank's溶液接触面积大,同时溶液通过颗粒间缝隙进入与钛合金基体接触发生电偶腐蚀,加速了Mg的降解,从而引起pH值快速升高。随着Mg的降解,薄膜完整性遭到破坏,薄膜总量下降,导致pH值的下降。降解初期,10-1 Pa条件下样品的pH值较高,而100 Pa较低,且其pH值下降趋势更小,说明其降解更慢,持续释放Mg2+的时间更长。5~7 d后,各薄膜样品的pH值逐渐平缓,并且接近新鲜Hank's溶液pH值(7.40),说明各薄膜7 d后已完全降解。从耐蚀性角度来看,表面薄膜更为致密的100 Pa 的耐蚀性更佳,且100 Pa可持续释放Mg2+的时间更长,所以100 Pa条件是较好的实验条件。

镁基金属作为生物医用材料的应用历史悠久,各种形式的镁基金属如螺钉、骨板、棒材等均得到广泛的研究,但Mg作为薄膜使用的相关报道较少[25,27,28]。Mg作为薄膜应用的优势在于既可以发挥基体材料的力学性能,又可发挥Mg的多重生物功能性。将纯Mg薄膜制备于多孔钛合金表面,可促进新骨的生成,并且有更多的新生骨长入多孔钛合金基体的内部[29]。这种复合了Mg薄膜的多孔材料有望用于人工关节材料以提高植入器件与人骨的整合,从而提高人工关节的稳定性。Mg薄膜降解的碱性环境使植入器件本身具有抗菌作用,这抑制了植入初期的细菌感染,将大大提高手术的成功率。Mg薄膜的应用给松动和感染这2个人工关节面临难题的解决带来了希望。

4 结论

(1) 采用多弧离子镀法在钛合金表面成功地制备出纯Mg薄膜。

(2) Mg薄膜表面颗粒均匀致密,未见明显缺陷。100 Pa薄膜表面更为致密,耐腐蚀性更理想,从功能性纯Mg的长期释放角度来看,100 Pa条件下获得的Mg薄膜降解过程更长,更适合植入器件的应用。

(3) 各个条件下的纯Mg薄膜对金黄色葡萄球菌具有强烈的杀灭作用,表现出良好的抗细菌感染功能,纯Mg薄膜浸提液对兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)具有促进增殖作用。

The authors have declared that no competing interests exist.


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