金属Mg是人体中的常量元素,其密度、Young's模量与人体骨接近,生物相容性优异,一些临床研究发现Mg及其合金植入后在体内发生降解,并促进骨愈合^[1,2],已成为了最有临床应用潜力的可降解的骨内固定材料。但医用Mg在体内降解速率过快,降解过程中产生大量H₂,使周边微环境碱性化,不利于细胞生长,形成气泡空腔,难于骨愈合,造成植入体失败^[3]。因此,可降解医用镁合金围绕如何减缓降解速率使其与骨生长速率相匹配成为研究的主要方向。提高合金耐腐蚀性能,一是净化Mg (纯Mg)或添加合金元素^[4,5];二是对镁合金表面进行各种改性,通过膜层改善其降解性。表面处理技术中的微弧氧化(micro-arc oxidation,MAO)是近些年发展最快且耐蚀性提高最好的方法^[6]。微弧氧化过程中,金属Mg在电解液环境下,通过加压或达到一定电流密度,微区产生弧光放电,瞬间材料表面产生高温氧化形成内致密、外多孔的氧化陶瓷膜层,膜层与基体呈冶金结合,提高了合金的耐磨性和耐蚀性^[7,8]。但深入研究发现,微弧氧化膜层存在贯穿孔隙和微裂纹,作为植入体在体液环境下发生点蚀或缝蚀,降解速率不易控制。将超声波引入到微弧氧化中,较传统微弧氧化具有较好的耐腐蚀性^[9],但膜层的贯穿孔隙仍难于控制。

为了使医用镁合金微弧氧化膜层植体具有合适的降解速率,并赋予植体表面生物活性,课题组提出纯Mg表面多元化复合处理技术,微弧氧化技术与浸渍技术复合,利用浸渍液通过毛细作用,填充于微弧氧化的贯穿孔隙中实现封孔,微弧氧化膜层表面也覆盖一层浸渍膜。浸渍膜作为Mg植入体材料的一部分,首先与骨组织界面的成骨细胞发生相互作用,其成分及形态将对细胞的增殖、分化及成骨行为产生重要影响。因此,浸渍物选择条件要无毒副作用,利于细胞增殖、分化和早期的骨结合,还要具有偶联Mg及MgO功能,浸渍膜层应具有良好的耐蚀性,实现植入体在体内降解速率的控制。硅烷化处理(SCA)是一种环保性的金属表面浸渍处理方法,具有低成本、无毒及操作简便的特点,已在铝合金和钢铁表面得到应用^[10-12]。硅烷偶联剂通常用YSIX₃通式表示,X表示可水解基团,Y代表不可水解基团,这种化学结构,既能和无机质结合又能和有机质结合,硅烷分子水解后的硅醇能够和Mg及MgO、羟基发生反应,热固化使硅烷分子自缩合形成无机/有机膜层,进一步提高合金耐蚀性^[13,14]。为了赋予与骨组织接触的最表层膜层优异的生物活性,利用硅烷与有机质结合特点,引入丝素结构蛋白(SF)。丝素蛋白含有 18 种氨基酸,其中甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸约占氨基酸总数的85%,是天然高分子纤维蛋白^[15,16]。丝素蛋白具有良好的生物相容性和降解特性,且降解产物无毒性,很多学者^[17-19]利用其与骨中的胶原蛋白的相似作用,诱导骨生长。丝素蛋白由于其溶失率较大且不稳定,硅烷正好作为中间介质连接基体及氧化与丝素蛋白,形成多元化复合膜层,既可控制合金的降解速率,又有优异的生物活性。

本工作提出纯Mg表面多种复合处理方法,利用超声微弧氧化(UMAO)技术在纯Mg表面形成以MgO为主体的陶瓷层;其次将UMAO膜层经NaOH碱处理表面获得较多的-OH基团,即UMAO-OH;再通过硅烷偶联浸渍连接陶瓷层,即UMAO-OH-SCA;最后组装丝素蛋白,简称UMAO-OH-SCA-SF,形成多元复合膜层。硅烷偶联剂固化工艺已进行前期探讨^[20],本工作研究外表层组装丝素蛋白对膜层组织结构及耐蚀性、对体外细胞增殖及活性影响、多元复合膜层体内外降解及对骨整合的影响规律。通过该研究期望为骨板、骨钉等提供新型多元复合可降解医用纯Mg骨内固定新材料,为其临床应用提供理论依据和实践基础。

1 实验方法

选用2种形状纯Mg材料(99.9%,质量分数),薄片试样尺寸为10 mm×10 mm×1 mm;种植体螺钉规格M3×6 mm。试样前处理分别采用NaHCO₃溶液(80 g/L)和H₃PO₄溶液(100 g/L)去除表面油污和氧化膜。微弧氧化设备为哈尔滨工业大学研制的30 kW双极性脉冲微弧氧化电源,工艺参数为电压300 V,脉冲频率500 Hz,脉宽50 μs,氧化时间8 min,阴阳极间距离40 mm。电解液在超声波环境下微弧氧化,超声波频率60 kHz,电解液选为硅酸盐体系,Na₂SiO₃为15 g/L,并添加少量NaOH和KF,得到UMAO膜层。

将UMAO膜层放入浓度为3 mol/L的NaOH溶液中,在60 ℃、1 h进行碱热处理,利于与硅烷偶联,简称UMAO-OH。硅烷偶联剂(KH-550)与乙醇和蒸馏水三者的体积比为1:10:1,进行硅烷偶联剂的水解,超声波振荡直至溶液为均匀无色透明,并沉化。

采用浸渍-提拉法将UMAO-OH试样浸渍到硅烷水解液30 s后提拉,待底部溶液落尽,再浸入水解液中,经反复3次涂覆后,浸5 min取出试样甩干,放在烘箱80 ℃、1 h固化成膜,简称UMAO-OH-SCA。丝素蛋白溶液的制备是将10 g丝素蛋白粉末溶解于CaCl₂:CH₃CH₂OH:H₂O的摩尔比为1:2:8的100 mL三元溶液中,在70 ℃下超声搅拌反应成均匀混合溶液,室温下将其装入截留分子量为9000~12000 Da的透析袋中,在流动水中透析3~4 d,除去溶液中的CaCl₂和CH₃CH₂OH,制备成丝素蛋白水溶液。将制备的UMAO-OH-SCA膜层试样浸泡在丝素蛋白溶液中,浸泡时间分别为0.5、1和1.5 h,取出甩干,各称为UMAO-OH-SCA-SF/0.5h、UMAO-OH-SCA-SF/1h、UMAO-OH-SCA-SF/1.5h。

采用JSM-6360LV型扫描电子显微镜(SEM)观察不同膜层表面及断面形貌,并利用能谱分析仪(EDS)进行元素含量分析。将不同膜层表面刮下的粉屑与KBr均匀混合后压制成块,采用VECTOR33型Fourier变换红外光谱仪(FTIR)在分辨精度为4 cm^-1、扫描波长为400~4000 cm^-1的条件下对膜层粉块中官能基团的组成进行测定。

膜层接触角测定采用液滴法,设备型号JC2000C1,在试样的表面滴0.0005 L蒸馏水,当液滴稳定后,通过摄像机拍摄,量角法对图像进行测定分析,每个试样测量5次,取平均值。膜层电化学腐蚀性能测定采用VersaSTAT 3电化学工作站,饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极,Pt片为辅助电极,试样为工作电极,在生理盐水有效暴露面积为1 cm²,扫描速率为0.5 mV/s。

细胞相容性实验取UMAO为对照组,实验组选择UMAO-OH-SCA-SF/0.5h和UMAO-OH-SCA-SF/1.5h。采用环氧乙烷消毒灭菌。采用CCK-8 (细胞计数试剂盒)检测成骨细胞增殖情况：将消毒灭菌后的每组试件各取12块分别放置于24孔板中,细胞接种的浓度为5×10⁴ cells/mL,放入恒温培养箱中,培养时间为1、3和5 d,每一个时间点设3个复孔,PBS轻轻冲洗后,重新放置在另外的24孔板中,加入培养液和CCK-8试剂,再培养2 h后取出,吸取200 μL上清液移入96孔板中,用酶标仪检测在450 nm波长下的吸光度。碱性磷酸酶ALP检测成骨细胞活性实验按上述方法接种细胞,分别培养1、4和7 d后取出各组试件,用PBS清洗3次,弃上清,用胰蛋白酶处理制成细胞悬液移入1.5 mL离心管中离心后弃上清,每孔加入200 μL 0.2%Triton X-100裂解液,37 ℃孵育20 min,离心取上清液移入96孔板,放置在4 ℃冰箱中过夜,然后取出上清液,使用酶标仪在450 nm下检测吸光度。

体内种植实验取已适应生长环境的白兔27只,平均约为4.5~5月龄,体重为2.6~2.7 kg。纯Mg种植体钉,尺寸为直径3 mm、长6 mm。试样分组与细胞实验相同,植入时间分别为2周、4周和6周。分别将植体植入兔子的下颌骨,每侧下颌骨植入同种材料种植体2枚,见图1a。术前注射抗生素预防感染,用速眠新II麻醉,分离皮下肌肉及筋膜,在距下颌骨下缘约0.8 cm处选择种植位点,2个位点间距约3~3.5 mm,球钻定位,逐级预备,植入种植体,逐层缝合。

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图1   种植体植入及下颌骨块取材

Fig.1   Pure Mg screw implantation (a) and sampling on the mandible (b)

种植体植入2周、4周和第6周处死兔子取材并制作脱钙切片。先对兔子进行麻醉,然后耳缘静脉空气栓塞处死兔子。截取带种植体的下颌骨块,见图1b。将标本上的软组织及骨膜清理干净并分割成10 mm×7 mm的小块。在中性福尔马林溶液中固定24 h,然后用流水冲洗30 min去除表面福尔马林。微波脱钙是将骨块放入微波专用盒里,加入脱钙液(15%EDTA),每次微波辐射时间为5 min,每次微波辐射后冷却8 min,每天约进行50次,脱钙4 d。常温脱钙是将骨块放入标本盒中,加入脱钙液,在4 ℃冰箱中保存,每7 d换一次脱钙液,45 d后脱钙完成。将脱钙后的标本酒精梯度脱水、二甲苯透明、在蜡中浸润、石蜡包埋、切片及裱片与烤片。

苏木精伊红(HE)染色是将常温脱钙切片用二甲苯脱蜡,二甲苯与无水乙醇处理及乙醇梯度处理,用苏木精染色、分色、蓝化处理后,再用乙醇梯度处理,伊红染色,无水乙醇处理,二甲苯与无水乙醇(体积比1:1)处理,最后用二甲苯透明2次,封片。免疫组化检测是将微波脱钙切片用3%过氧化氢(体积比)孵育,磷酸缓冲液(PBS) 0.01 mol/L冲洗3次,胃蛋白酶孵育10 min,PBS冲洗,5%正常山羊血清室温孵育10 min,去除血清,加入一抗,4 ℃冰箱过夜,用PBS冲洗,加入二抗,37 ℃孵育30 min,PBS冲洗,滴加ALP标记的链霉卵白素,37 ℃孵育30 min,显色剂(DAB)显色,酒精脱水,二甲苯透明,封片。血清中Mg浓度测量是将种植前一天和种植后2周、4周、6周各组动物分别抽取兔耳中动脉血,检查血清原始Mg²⁺浓度和不同处理的植体的Mg²⁺浓度变化。

采用SPSS-19统计分析软件进行细胞与植入的数据分析。

2 实验结果

2.1 膜层表面和断面形貌及元素分析

图2是纯Mg微弧氧化及丝素处理不同时间膜层的表面和断面形貌SEM像。单纯的UMAO膜层表面分布着大小不等的孔洞,膜层断面中有很多的孔洞未被完全填充,并有贯通的孔隙到基体。这些孔洞的存在,为体液这一腐蚀介质浸入提供有效途径,势必造成部分Mg基体发生腐蚀,影响了整体材料的耐腐蚀性能。经过硅烷偶联及丝素处理后,表面及断面分布的微孔数量随着浸入丝素时间的增加,膜层孔隙减少,复合处理后的膜层由于硅烷及丝素浸入,已将与Mg基体发生体液浸蚀反应的通道封闭。当SF处理时间为1.5 h时,涂层孔隙最少,且厚度最大。这是由于硅烷分子水解生成的硅醇与微弧氧化碱处理形成的MgO陶瓷层表面的羟基(MgO—OH—)发生了反应,硅烷分子发生自缩合而成膜,填充了微弧氧化的孔洞。另外,丝素溶液的附着性随着浸泡时间增加,进一步添充微孔成膜,使膜层更加致密。

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图2   不同膜层的表面和断面SEM像

Fig.2   Surface and section SEM images of different coatings
(a) UMAO (b) UMAO-OH-SCA-SF/0.5h
(c) UMAO-OH-SCA-SF/1.0h (d) UMAO-OH-SCA-SF/1.5h

图3是不同膜层表面元素分析。纯Mg UMAO膜层主要元素为Mg、O为主体,并有镀液带入的Si、Na、F和少量的K元素。经硅烷偶联和丝素进一步封孔发现,膜层有新元素N和C,并随着SF溶液浸泡时间的增长,N含量呈上升趋势。N元素全部来自于丝素蛋白溶液,C元素来自于硅烷及丝素。当SF浸泡时间为1.5 h时,N含量最多,达到6.57%,使膜层的生物活性得到提高。

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图3   不同膜层表面的元素含量

Fig.3   Element contents of the different coatings
(a) UMAO (b) UMAO-OH-SCA-SF/0.5h
(c) UMAO-OH-SCA-SF/1.0h (d) UMAO-OH-SCA-SF/1.5h

2.2 膜层FTIR分析

图4是不同膜层的FTIR谱。单纯UMAO膜层在波数为583 cm^-1处有Mg—O特征峰,为纯Mg微弧氧化后形成的MgO相;在1064 cm^-1处有—SiO₃^2-的特征峰,为硅酸盐镀液在微弧氧化反应中形成的MgSiO₃相。经过硅烷偶联和丝素处理不同时间膜层,还在波数为863、1034和1098 cm^-1处出现了一对Si—O—Si谱带,这均是硅氧烷中Si—O—Si的反对称伸缩振动特征峰。在2856和2920 cm^-1处出现了CH₃的吸收峰,这是—CH₃和亚—CH₃的对称和不对称伸缩振动所导致的。由此可推断,硅烷溶液水解为Si—OH后,在较短的时间里发生了缩合反应形成Si—O—Si键,经加热固化脱水,膜层与基体及氧化物形成共价键 —Si—O—Mg的连接。在波数为3442 cm^-1处出现明显的单峰是蛋白质N—H的伸缩振动特征峰,在波数为1636、1516和1235 cm^-1分别为酰胺I (C=O伸缩振动)、酰胺II (N—H变形振动)、酰胺III (N—H变角和C—H伸缩振动)的特征峰。浸泡丝素的膜层与丝素蛋白的红外光谱特征谱带对比,膜层中丝素蛋白是以β-折叠结构存在。

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图4   不同膜层的傅里叶变换红外光谱图

Fig.4   Infrared spectra of coatings with different treatment time

2.3 不同膜层表面对接触角的影响

图5是不同膜层的接触角图。UMAO膜层的表面接触角为10° ±1.3°,而UMAO-OH-SCA-SF复合膜层随着在SF溶液中浸泡时间的增加,膜层的表面接触角逐渐增大,当SF浸泡为1.5 h时,表面接触角达到最大值,为58° ±1.0°。这是由于复合膜层的表面形貌比UMAO膜层的表面形貌更均匀致密,孔隙减少,从而阻碍了水在涂层表面进行吸附和铺展,使润湿角增大。多元膜层也能够减少其它电解质溶液的吸附和铺展,在基体与外界腐蚀介质之间形成一层阻隔,起到耐腐蚀作用。

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图5   不同膜层表面的接触角

Fig.5   Contact angles of coatings with different treatment times
(a) UMAO (b) UMAO-OH-SCA-SF/0.5h
(c) UMAO-OH-SCA-SF/1.0h
(d) UMAO-OH-SCA-SF/1.5h

2.4 膜层的电化学腐蚀分析

表1为电化学耐腐蚀性能的相关参数,图6是不同膜层在生理盐水中的Tafel极化曲线。纯Mg UMAO及UMAO-NaOH-SCA-SF/0.5h、UMAO-OH-SCA-SF/1.0h、UMAO-OH-SCA-SF/1.5h处理的复合膜层曲线均右移,钝化区增加。自腐蚀电位E_corr比纯Mg UMAO膜层分别升高了72、93和107 mV,而自腐蚀电流密度i_corr均降低了2个数量级,膜层的耐蚀性能得到了提高。这说明纯Mg UMAO膜层的孔隙经过SCA转化处理和丝素浸泡组装后得到愈合,并形成防护层阻挡腐蚀介质与Mg基体的接触,有效保护了纯Mg基体。

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图6   不同膜的Tafel极化曲线

Fig.6   Tafel polarization curves of coatings with different treatment times

2.5 不同膜层对细胞增殖及活性的影响

图7是不同膜层CCK8检测细胞增殖及ALP检测细胞活性柱状图。通过对不同膜层细胞培养不同时间测定的OD (光密度)值比较发现,在相同时间内,UMAO-OH-SCA-SF/1.5h>UMAO-OH-SCA-SF/0.5h>UMAO;随着时间增加,细胞增殖及ALP活性检测的OD值均呈上升趋势,增殖幅度是UMAO-OH-SCA-SF/1.5h > UMAO-OH-SCA-SF/0.5h > UMAO。细胞增殖和活性比较以UMAO-NaOH-SCA-SF/1.5h最优,UMAO-NaOH-SCA-SF/0.5h次之,UMAO最小。CCK8细胞增殖与ALP活性的精细3种材料间相互比较均有差异。

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图7   不同膜层成骨细胞增殖及活性的柱状图

Fig.7   Osteoblast proliferation by CCK8 testing (a) and activity ALP testing (b) of different coatings

2.6 不同膜层体内植入实验结果

动物实验采用的材料与细胞实验相同。植入种植体的动物均在术后0.5 h内清醒,精神状态良好,创口没有感染现象发生,术后3 d进食量较少,之后逐渐恢复正常。

图8是植入不同时间苏木精-伊红染色种植体与骨组织结果。经过EDTA溶液的脱钙Mg钉已经降解,图8白色位置为Mg钉降解后的空隙。植入2周,UMAO组钉周围组织中仍可见粒细胞及成纤维细胞;UMAO-OH -SCA-SF/0.5h组钉与周围组织交界处纤维组织增生,靠近钉处细胞肥大,成层排列于表面,组织与钉之间未见炎性细胞及巨噬细胞;UMAO-NaOH-SCA-SF/1.5h组肥大的纤维细胞增生明显,呈多层次。植入4周,UMAO组Mg钉周围纤维组织中近钉侧细胞肥大,平行排列成层状,无明显骨细胞形成;UMAO-OH-SCA-SF/0.5h组植入体周围存在成层的成骨细胞,可见少量粉红色骨基质;UMAO-OH-SCA-SF/1.5h组钉周围纤维组织边上形成新生骨。植入6周,UMAO可见周围仍为纤维组织,存在岛状成骨区,成骨细胞周围骨基质形成,成骨细胞层状排列于周围;UMAO-OH-SCA-SF/0.5h 组钉周围形成新生骨组织,骨组织内可见纤维条素;UMAO-OH-SCA-SF/1.5h组,种植体周围形成大量新生骨,向成熟骨转化,骨内纤维排列渐渐整齐,骨组织越来越致密。

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图8   不同膜层植入体周围骨组织苏木精伊红(HE)染色

Fig.8   Hematoxylin eosin (HE) staining of different coatings around the implantation of UMAO (a1~a3), UMAO-OH-SCA-SF/0.5h (b1~b3) and UMAO-OH-SCA-SF/1.5h (c1~c3) for 2 weeks (a1~c1), 4 weeks (a2~c2) and 6 weeks (a3~c3)

图9是免疫组化染色的植入体-骨结合界面BMP-2平均灰度测定值。2周成骨UMAO-OH-SCA-SF/1.5h组最活跃,UMAO-OH -SCA-SF/0.5h次之,UMAO最小;随着植入时间的增加,各组植入体-骨结合界面BMP-2平均灰度值呈下降均势。2周、4周时各组之间的差异具有显著的统计学意义(p<0.01),6周时各组具有统计学差异,但UMAO-NaOH-SCA-SF/0.5h组与UMAO-NaOH-SCA-SF/1.5h组不具有统计学差异(p>0.05)。

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图9   不同膜层植入体-骨结合界面BMP-2平均灰度测定

Fig.9   BMP-2 average gray level testing on the coatings of different implantation-bone osseointegration interface

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图10   不同膜层植入动物中的血清Mg²⁺浓度变化

Fig.10   variation concentrations of Mg²⁺ in the animal serum with implant of different coatings

3 分析讨论

医用镁合金体内降解速率的控制是作为可降解骨固定材料能否临床应用的关键。近年来,表面微弧氧化处理后,在基体表面生成氧化膜,并通过电解液赋予膜层生物活性,成为当前控制合金腐蚀的最佳表面处理方法^[6]。为了使微弧氧化技术发挥更好的效能,课题组^[21]提出了超声波与微弧氧化技术相结合的新技术-超声微弧氧化(UMAO),微弧氧化电解液在超声波作用下,利于离子的传输,减少膜层贯通孔隙,一定程度上提高膜层的耐蚀性^[9],但膜层仍存在孔隙,在体内环境下发生点蚀。因此,对UMAO膜层后处理是控制体内降解速率的首要问题,通过设计多种后处理,获得多元复合膜层,进而实现控制体内的降解速率,并赋予膜层促进早期骨愈合能力。

纯微弧氧化膜层多种后处理,层与层之间或填充时保证良好的联接非常关键。通过对微弧氧化膜层碱处理后,使氧化表面载上大量的碱性羟基,增加其表面粗糙度。这与文献[22,23]等通过碱处理,可获得致密的MgO层作用一致。碱处理后MgO含碱性—OH与显酸性的硅烷羟基发生反应,实现偶联沉积硅烷膜。其机理是当硅烷水解时,与Si相连的3个Si—OR基水解形成 —Si—OH,可自缩合形成 —Si—O—Si— , —Si—OH还可以与MgO表面的—OH利用氢键作用,加热固化过程伴随有脱水反应,形成 —Si—O—Mg共价键的连接^[24,25]。硅烷偶联剂利用孔隙的毛细作用,附着Mg基体表面,微弧氧化后碱处理为硅烷润湿铺展提供有利的条件,进而实现了对UMAO封孔和成膜作用,提高膜层的耐蚀性。丝素蛋白是从蚕丝中获得的天然纤维蛋白,属于结构蛋白,富含多种氨基酸,SF分子中独特的疏水链与亲水链间隔排列,可在水溶液中实现自组装^[26,27]。将UMAO-OH-SCA膜层浸泡在SF溶液中,无定形区域的丝素肽链侧链上的N原子与膜层表面的羟基通过配位键以及氢键的作用,影响了N—H的伸缩振动频率,随着浸泡时间增加,当SF浓度增加,将无规线团结构转变为β-折叠结构,且β-折叠结构含量随着SF浓度的增加而迅速增加,使SF溶液的结构由无规卷曲向β-折叠转变,发生自组装。通过红外光谱分析得到证实,浸泡丝素的膜层与SF的FTIR特征谱带对比,是以β-折叠结构存在,这也进一步证明了纯Mg经碱处理表面羟基与硅烷反应发生偶联,UMAO-OH-SCA复合膜层表面的羟基和无定形区域的丝素肽链侧链上的N原子存在着氢键、配位键,从而影响了N—H的伸缩振动频率,促使SF结构由无规卷曲向β-折叠结构转变。纯微弧氧化膜层经碱处理、硅烷转化膜处理、自组装丝素多种处理,获得的多元膜层,经SEM观察表面形貌及元素分析发现,随着丝素浸泡时间增加,膜层孔隙减少,N、C元素含量增加,实现了对微弧氧化膜层多次封孔。电化学腐蚀实验证明,微弧氧化膜层多次封孔的多元膜层,提高了耐蚀性。

在生物体内,细胞生活在细胞基质的微环境中,细胞外基质与细胞进行着物质和信息的交流^[28]。Marolt等^[29]将骨髓间充质干细胞(h BMSC)种植到丝素多孔支架上,在含成骨诱导培养基的生物反应器中培养,表明h BMSC 能够在丝素多孔支架上增殖,并能够提高碱性磷酸酶的含量,说明该支架对h BMSC 具有良好的成骨诱导效应。Karageorgiou 等^[30]把骨修复蛋白(BMP-2)固定到丝素膜上,丝素膜能够促进人骨髓间充质干细胞的分化。本工作纯Mg微弧氧化膜层经碱处理、硅烷转化膜处理、自组装丝素多种处理,获得有利于细胞生长的表面修饰膜层,为成骨细胞生活提供有利的细胞外基质的微环境中,体外细胞实验CCK-8与ALP实验结果证实,虽然单纯的UMAO膜层利于成骨细胞的黏附,有一定的生物活性,但纯Mg微弧氧化膜层经碱处理、硅烷转化膜处理、自组装丝素多种处理膜层,细胞增殖和碱性磷酸酶生物活性增加的更大,随着丝素蛋白的浸泡时间延长,丝素浸泡时间0.5和1.5 h差异性增加,浸泡1.5 h膜层成骨细胞的增殖和细胞活性更高。由于硅烷与丝素双重封孔,减缓Mg的降解速率,减弱了培养液的碱化程度,降低H₂的释放率,为成骨细胞黏附和生长提供更稳定的环境。因此,纯Mg微弧氧化膜层经碱处理、硅烷转化膜处理、自组装丝素多种复合处理后,由于表层的丝素蛋白存在,能够很好的行使天然细胞外基质的某些功能,促进细胞生长、引导细胞迁移、分化。

材料植入机体后与周围骨组织发生作用,植入材料相当于异物,造成骨组织损伤,骨组织损伤后愈合过程中,促使机体中众多生长因子被激活,其中BMP-2是较早出现促进骨组织形成且在BMP家族中活性最强的生长因子^[17]。对2、4和6周各组植入体周围骨缺损区组织BMP-2进行免疫组化灰度值测量,表明UMAO-OH-SCA-SF/1.5h 多种复合处理的植入体,骨组织交界处BMP-2表达最高,很好地促进了骨愈合。HE染色的组织观察表明,植入2周时,超声微弧氧化钉周围组织有粒细胞及成纤维细胞,组装丝素0.5 h发现纤维组织增生,成层排列于表面,组装丝素1.5 h的纤维细胞增生明显,呈多层次。植入4周时,超声微弧氧化钉无明显骨细胞形成;组装丝素0.5 h组植入体周围存在成层的成骨细胞,组装丝素1.5 h组出现散在小岛状成骨。植入6周,超声微弧氧化钉周围可见岛状成骨区,成骨细胞层状排列于周围;组装丝素0.5 h钉周围形成片状骨组织并可见骨髓腔形成;组装丝素1.5 h组,种植体周围形成连续片状成骨,骨髓腔形成。可见,组装丝素蛋白的多元膜层与单纯微弧氧化膜层比,4周时材料和骨缺损之间骨质进一步成熟,新生骨层上有排列整齐的骨细胞,具有更好的骨形成能力。

另外,Mg钉在体内的降解速率,可从体内血清中浓度变化间接表示。从植体动物体内血清中Mg²⁺浓度变化可见,超声微弧氧化膜层及复合处理多元膜层植入均能保证血清中Mg²⁺在正常值范围内^[31]。其中组装丝素膜层比超声微弧氧化膜层更能减缓离子的释放。文献[32]制备多孔丝素支架降解吸收时间约为28周,丝素膜第28周时仍然保持着较完整的形态,这说明丝素膜层在体内的降解速率十分缓慢。由于纯Mg微弧氧化膜层经碱处理、硅烷转化膜处理、自组装丝素多种复合处理后形成多元膜层,起到了保护作用,延缓Mg的降解速率。另外,植入体的动物基体本身具有自我调节能力,植体与骨组织界面形成的纤维组织有可能在界面重新形成阻挡层,减缓Mg²⁺溶出。

4 结论

(1) 纯Mg超声微弧氧化膜层经碱处理保留表面的碱性羟基,在硅烷转化膜处理中利于Si-O-Mg结合成膜,该膜层在自组装丝素中,无定形区域的丝素肽链侧链上的氮原子与膜层表面的羟基通过配位键以及氢键的作用,影响了N—H的伸缩振动频率,随着浸泡丝素蛋白量增加,使丝素蛋白溶液的结构由无规卷曲向β-折叠转变。

(2) 纯Mg通过微弧氧化-硅烷偶联,再组装丝素蛋白,随着浸泡时间的增加,使膜层更致密均匀,提高自腐蚀电位,而自腐蚀电流密度降低了2个数量级。

(3) 纯Mg超声微弧氧化膜层及多元复合膜层,均能促进成骨细胞的黏附、增殖与分化。UMAO-OH-SCA-SF/1.5h多种复合处理形成的多元膜层富含N,细胞相容性最优,浸泡丝素蛋白0.5 h次之,UMAO膜层最小。

(4) 体内植入表明UMAO-OH-SCA-SF多元膜层具有良好的早期骨整合能力和Mg²⁺溶出控制能力,其中,UMAO-OH-SCA-SF/1.5h最佳。

The authors have declared that no competing interests exist.